Summary

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Published: October 26, 2017
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Summary

ここで生体内でリプログラミングを誘導しながら傷害時に骨格筋の老化の両方を検出するための詳しいプロトコルおよび多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、組織の再生中に細胞の老化の役割を評価し、生体内リプログラミングに適しています。

Abstract

細胞の老化は、がんや高齢化など多くの生理学的および病理学的プロセスのために重要である安定した細胞増殖停止によって特徴付けられるストレス反応です。最近では、老化は組織の修復と再生にも関与しています。したがって、それは体内老化細胞を識別するますます重要になっています。老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) アッセイは、老化細胞の文化とin vivoの両方を検出する最も広く使われている試金です。この試金は、ライソゾームの β-ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出 (6 または 5.5) 以下の pH でことができます老化細胞のライソゾーム含量の増加に基づいています。これにより形態, 組織アーキテクチャに関する場所など貴重な情報を提供しています彼らの居住環境における老化細胞の同定、フローサイトメトリーなど、他の試金と比較して、免疫組織染色 (IHC) を介して他のマーカーとの結合の可能性。SA β Gal 試金の主要な制限は、新鮮なまたは冷凍サンプルの要件です。

ここで、どのように細胞老化を理解するための詳しいプロトコルは提示細胞の可塑性と組織再生の生体を促進します。怪我の組織再生を研究するのに確立されたシステムに骨格筋の老化細胞を検出するのに SA β Gal を使用します。さらに、トランスジェニック マウス モデルの Nanog、多能性幹細胞のマーカーを検出するのに IHC を使用します。このプロトコルを調べるし、細胞の老化誘導細胞の可塑性と生体内でリプログラミングのコンテキストでを定量化することが出来ます。

Introduction

細胞の老化は、安定した細胞周期の阻止によって特徴付けられるストレス反応の形式です。研究は過去 10 年間で、老化が萌芽期の開発、線維化、生物1,2の高齢化などさまざまな生物学的および病理学的プロセスに関連付けられていることをしっかりと確立しています。細胞の老化は、テロメアの短縮3によって引き起こされる彼らの分裂寿命の終わりに線維芽細胞で初めて確認されました。複製ストレスのほか、DNA 損傷、酸化ストレス、がん化シグナル ゲノム ・ エピゲノムの変化、うちのどれかが最終的に p21/p53 および pRB の細道を起動などの老化を引き起こすことができる他の多くの刺激があります。確立し、永続的な成長逮捕1を強化します。老化細胞の重要な特性の 1 つは、彼らは代謝活性が維持され老化関連の分泌形質 (SASP) を力強く表現: 多くの炎症性サイトカイン、増殖因子、細胞外マトリックスの分泌要因4。SASP の要因は、媒介と増幅老化作用、免疫細胞を集め、ローカルおよび全身の組織調査1を変更することで、強力な効果のために重要な役割を果たすに提案されている.興味深いことに、老化が最近組織修復と再生5,6の重要であると提案されています。さらに、我々 を含む、いくつかのラボからのデータは組織損傷が誘導する老化が再生79を促進するために、SASPs による細胞の可塑性を高める可能性を示唆しています。したがって、すべての新たなデータは、老化で生体を調査する重要性を強調表示します。

細胞の可塑性は、ポスト誘導多能性幹細胞 (iPSC) 時代文化とin vivo10の異なる刺激にさらされると代替運命を採用する新しい id を取得するセルの能力です。におけるリプログラミング達成体内11,12, をすることができます知られている場所の表現、山中 4 因子を含むカセット: Oct4Sox2Klf4、C-myc (OSKM) が誘導体内の複数の臓器の奇形の形成を促進することができます。したがって、重要な規制当局と細胞の可塑性11にとって重要な経路を識別するために、強力なシステムとして再マウス モデル (i4F) を使用できます。

適切かつ敏感な体内システムがどのように細胞老化の理解に不可欠な組織再生における細胞の可塑性が調節します。ここでは、堅牢なシステムと老化と組織再生における細胞の可塑性の間のリンクを評価する詳細なプロトコルを提案します。(TA) 脛骨前方筋群、組織再生や i4F マウス モデルを研究する万全の体制で cardiotoxin (CTX) の組み合わせによる筋肉の損傷により細胞老化のin vivo検出筋再生中にプログラムし直します。

老化と細胞の可塑性の間のリンクを評価するには、i4F マウスは急性の筋肉の損傷を誘発する CTX と負傷、生体内でリプログラミングを誘発するドキシサイクリン (0.2 mg/mL) 7 日間で治療します。CTX 誘発急性筋肉の損傷、再生プロトコルは、倫理的な理由の最近公開された13をされている、現在のプロトコルでこの手順が省略されます。老化細胞のピークが以前14を観察されているとき、10 日間のポスト傷害13TA 筋サンプルが収集されます。ここでは、この詳細なプロトコルは、(SA β Gal) を経由して老化のレベルと (IHC 染色 Nanog) 経由でリプログラミングを評価するために必要なすべての手順を説明します。

老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) アッセイは、文化とin vivo15の両方老化細胞を検出する最も一般的に使用される試金です。その他の試金に比べると、SA β Gal 試金はそのまま組織アーキテクチャでは、生体内で調査のため特に重要です彼らのネイティブ環境における老化細胞の同定をことができます。また、カップルは IHC を使用して他のマーカーと SA β Gal 試金することが可能です。ただし、SA β Gal 試金は、主な制限のまま新鮮なまたは冷凍のサンプルを必要は。新鮮なまたは冷凍の組織は TA 筋サンプルを冷凍など、日常的に使用できるが、SA β Gal は明らかに老化細胞を検出する最も適切な試金です。Nanog は 2 つの理由 reprogramed の細胞を検出するために使用されるマーカー: 1); 多能性の重要なマーカーは2) もっと重要なは、その表現はないドキシサイクリン (dox) によって駆動される、山中カセットの強制発現ではなく誘導多能性を検出するため。

本論文で示したプロトコルを汚す定量化手順を簡素化する個別に行うことができるが、また老化の両方を可視化する共同染色手順と同じセクションを多能性幹細胞で行うことができます注意してくださいが重要です。

Protocol

欧州共同体ガイドラインとの Institut パスツール (CETEA) 承認プロトコルの倫理委員会に従って処理された動物。 1。 在庫ソリューションの準備 筋サンプル固定のための材料を準備します。筋固定のため凍結埋め込み媒体に RT で 20 mL の水で tragacanth ガムの 0.5 g を溶解します。 SA β Gal の汚損のためのソリューションを準備します。 溶液 …

Representative Results

筋肉傷害による細胞老化の検出 最近では筋損傷が細胞の老化が過渡14を誘導すること示されています。10 日後に損傷 (DPI)、損傷した筋線維の大部分は、中心部にある核、再生、筋線維の特徴と再生を受けているし、筋のアーキテクチャが再確立されました。浸潤炎症細胞が特定の地域で表示を維持しながら…

Discussion

ここでは、リプログラマブル マウスの骨格筋の老化の両方を検出する方法と、多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、評価、両方老化を定量化し体内細胞の可塑性、誘発して組織の修復・再生老化の役割を調べるに使用可能性があります。

現在のプロトコル老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) 試金を使用して、骨格筋における体内老化細胞を検?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

彼女の優れたテクニカル サポートの Clemire Cimper にお世話になっております。H.L. の研究室での仕事は、パスツール研究所、凝った科学センターの注ぐラ ・ アジャンス ナシオナル デ ラ凝った (フランス d’Excellence リバイブ、Investissement d’Avenir; によって賄われていたANR-10-LABX-73)、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR-16-CE13-0017-01) および財団アーク (PJA 20161205028)。C. c. と交流は、博士・復活のコンソーシアムからドクターによって賄われています。

Materials

K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

Referências

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Citar este artigo
Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

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