AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo
Summary
Het gebrek aan instrumenten voor het meten van de materiaaleigenschappen en spanning parameters in vivo kunnen valideren hun rol tijdens de ontwikkeling. Wij werkzaam atomaire kracht microscopie (AFM) en nanoparticle-tracking te kwantificeren van mechanische functies op de intact zebrafish embryo dooier cel tijdens epiboly. Deze methoden zijn betrouwbaar en breed toepasbaar vermijden opdringerig interventies.
Abstract
Het ophelderen van de factoren die de spatio-temporele organisatie direct van de zich ontwikkelende weefsels is één van de primaire doeleinden in de studie van ontwikkeling. Verschillende stellingen beweren te zijn belangrijke bijdragen aan het begrip van de mechanische eigenschappen van cellen en weefsels in hun Spatio organisatie in verschillende ontwikkelings- en morfogenetische processen. Echter, als gevolg van het ontbreken van betrouwbare en toegankelijke instrumenten voor het meten van de materiaaleigenschappen en spanning parameters in vivo, het valideren van deze hypothesen is moeilijk geweest. Hier presenteren we methoden gebruik van atomaire kracht microscopie (AFM) en de particle volgen met als doel het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de intact zebrafish embryo dooier cel tijdens epiboly. Epiboly is een vroege geconserveerde developmental proces wiens studie wordt vergemakkelijkt door de transparantie van het embryo. Deze methoden zijn breed toepasbaar, eenvoudig te implementeren en betrouwbaar aangezien zij overwinnen opdringerig interventies die invloed kunnen hebben op de mechanica van het weefsel. Een eenvoudige strategie werd toegepast voor de montage van specimens, AFM opnemen en nanoparticle injecties en volgen. Deze aanpak maakt deze methoden gemakkelijk aan te passen aan andere ontwikkelingsstoornissen keer of organismen.
Introduction
De fysische principes die ten grondslag liggen aan de biomechanische controle van morfogenetische processen zijn grotendeels ongedefinieerd. Terwijl biomechanische studies op de moleculaire en cellulaire niveau zijn het verzamelen van aanzienlijke dynamiek, is de verkenning van biomechanische parameters op het niveau van het weefsel/organisme in de kinderschoenen. Hydrodynamische regressie1 of Video kracht microscopie2 onderzoekers onderscheiden van actieve en passieve krachten, terwijl de laser microchirurgie3, of de minder opdringerig atomaire kracht microscopie (AFM) van gedissocieerde cellen4 of in vivo 5 of nanoparticle microrheology6 toestaan de anticipatie van een weefsel van mechanische eigenschappen en reacties.
AFM is een driedimensionale topografische techniek met hoge atomaire resolutie oppervlakteruwheid en naleving van de uitwijking van cantilever tips bij contact met een peilden oppervlakte7oplossen. Verschillende methodologieën AFM in dienst hebben ontwikkeld om te onderzoeken van de oppervlakte-eigenschappen, met inbegrip van het meten van de wrijving, hechting krachten en visco eigenschappen van verschillende materialen. Onlangs, AFM heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor het ophalen van informatie over de mechanische eigenschappen van biologische monsters. In het bijzonder kan AFM niet-gebeurt pak de complexe afschuifmodulus uit afzonderlijke cellen door oscillerende inkepingen met een micro tip gekoppeld aan een cantilever van bekende buigende constante8toe te passen. Dit laat ons afleiden van de resulterende krachten. Nog, AFM is niet uniek en verschillende methodes kunnen uitpakken Rheologische gegevens en mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen (bijvoorbeeld micropipet aspiratie9, magnetische cytometry (MTC)10draaien, of eenassige treksterkte testen van11).
De toepassing van deze nieuwe methodologieën op complexe morfogenetische processen is echter niet eenvoudig. De belangrijkste uitdagingen bij de bepaling van de mechanische eigenschappen van embryonale weefsels worden de kleine (µm tot mm), zacht (in de 102 – 104 Pa bereik) en visco-elastisch (die aanleiding geven tot tijdafhankelijke verschijnselen) aard van de materiële12. Daarom is het belangrijk aan te passen van de toegepaste methoden voor de bepaling van de mechanische eigenschappen (stijfheid, viscositeit, adhesie) op het specifieke geval van embryo’s en ontwikkelende organismen. Twee belangrijke kwesties moeten worden rekening gehouden bij het analyseren van de reologische benaderingen te bestuderen ontwikkeling: opdringerig interferentie te voorkomen en te zorgen voor gemakkelijke toegankelijkheid. In dit scenario vertonen micropipet aspiratie, MTC en testen van de treksterkte beperkingen. In het eerste geval, kan de hoge vervorming dat een cel lijdt zijn fysiologische en mechanische eigenschappen9worden gewijzigd. In het tweede geval kon moet stevig vasthouden de experimentele weefsel op een substraat om ervoor te zorgen dat de stress toegepast het cytoskelet lokaal vervormen ook gevolgen voor de activeringsstatus van de cellen en, vandaar, in hun mechanische eigenschappen10 voeren . Laatste, eenassige treksterkte benaderingen zijn beperkt door de geometrie van de ontwikkeling van organismen en toegankelijkheid11.
AFM lijkt beter geschikt voor de studie van de ontwikkelings processen als het toelaat de studie van biologische monsters rechtstreeks in hun natuurlijke omgeving zonder enige omslachtig monstervoorbereiding. Bovendien, zoals dissociatie van embryonale weefsels over het algemeen moeilijk is, de beperkte grootte van AFM sondes biedt een hoge mate van veelzijdigheid zonder beperking in de keuze van het type medium (waterige of niet-waterige), temperatuur van het monster of chemische samenstelling van het monster. AFM is veelzijdig genoeg om te worden toegepast op grote domeinen en tijd schalen en om op te halen van de materiaaleigenschappen van weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia of fysiologische omstandigheden heeft gewerkt. Geheel eigen weefsels zoals slagaders13 of botten14 zijn bestudeerd vanuit het oogpunt van topografische en in sommige gevallen, zoals de sclera, mechanische eigenschappen zijn ook ontvangen15. Topografie is ook onderzocht in levende embryo’s waardoor de visualisatie van, bijvoorbeeld, cel omlegging tijdens morfogenese in Xenopus16. Laatste, uitgebreide steekproef voorbereiding protocollen hebben ontwikkeld om te bepalen van mechanische parameters tijdens verschillende ontwikkelings processen. Nanoindentation kaarten zijn gegenereerd op inheemse nietgefixeerde weefselsecties voor de chick embryonale spijsverteringskanaal11; zelfklevend en mechanische eigenschappen opgehaald voor individuele ectoderm, mesoderm en endoderm voorlopercellen geïsoleerd van gastrulating zebrafish embryo’s4; stijfheid metingen voor de epiblast en de primitiefstreek op explantaten van aviaire embryo’s17; en een verschillend patroon van stijfheid verlopen rechtstreeks gedefinieerd in het embryonale brein van Xenopus5.
Een belangrijke kwalitatieve sprong voorwaarts voor de toepassing van AFM voor het verkennen van de embryonale ontwikkeling kan afkomstig zijn van het naderen van eenvoudige toegankelijk morfogenetische processen. Zebravis epiboly is een essentieel en geconserveerde evenement, waarin verschillende weefsels en in een beperkte sferische ruimte coördineren om de uitbreiding van de blastoderm in een paar uur. Op het begin van de zebravis epiboly (sferische fase) dekt een oppervlakkige laag van cellen, de omhullende laag (EVL), een semi-sferische cap van blastomeren gecentreerd op de paal dier van het embryo zittend op een massale dooier syncytieel cel. Epiboly bestaat uit de uitbreiding van de corticale plantaardige ward van de EVL, de diepe cellen (DCs) van de blastoderm, en de externe laag van de syncytieel dooier cel (E-YSL) rond de eidooier. Epiboly eindigt met de sluiting van de EVL en de DCs op de vegetal pole18,19,20. Hoe en waar troepen worden gegenereerd tijdens epiboly en hoe zij wereldwijd zijn gekoppeld is nog niet duidelijk1,21.
Hier beschrijven we in detail hoe toe te passen van de AFM om te concluderen passieve mechanische weefsel eigenschappen tijdens epiboly progressie in de zebravis dooier cel in vivo. Om dit te doen, we klein microsferen gekoppeld aan AFM uitkragingen als sondes gebruikt. Hierdoor is het ophalen van de precieze lokale informatie binnen het celoppervlak van niet-uniforme dooier en te bestuderen of spanning verlopen en hun dynamiek na verloop van tijd. Alternatieve AFM benaderingen zoals die gebruik maken van de wig uitkragingen22, zal niet render lokale gegevens die nauwkeurig genoeg is. De techniek van de wig, waarvoor zeer voorzichtig manipulatie vaardigheden naar een wig groter is dan de grootte van de steekproef aan het einde van de uitkraging lijm, is niet goed geschikt voor indringende embryo (~ 2-fold groter is dan de lengte van de uitkraging) mechanica.
Modellering en karakterisering van de visco-eigenschappen van de cellen in kwalitatieve en kwantitatieve manieren zorgt voor een beter begrip van hun biomechanica. Vanuit een biomechanische oogpunt is het essentieel om te begrijpen epiboly, en niet alleen vraag naar kennis over corticale spanning metingen en de dynamiek, die kunnen worden geëxtraheerd door AFM; Er is dus behoefte aan informatie over de biofysische eigenschappen van het weefsel. Om deze informatie, een verscheidenheid van cel reologie technieken zijn ontwikkeld door de jaren heen om het karakteriseren van verschillende celtypes onder verschillende fysiologische omstandigheden23. Zij omvatten AFM, MTC en optisch pincet (OT). Deze methoden, echter hebben bewezen ontoereikend voor mesoscopische analyses op de schaal van embryo’s of organen. Als alternatief hebben wij met succes nanoparticle-tracking microrheology6 voor in vivo Rheologische metingen aangepast. Deze techniek analyseert de Brownse verplaatsingen van individuele deeltjes en eigenschappen van de lokale micromechanische afleidt.
Samen AFM en nanoparticle microrheology toestaan dat de definitie van corticale spanning dynamiek en interne mechanische eigenschappen van de dooier tijdens epiboly. Deze informatie onderschrijft volledig een model waarin anisotrope stress ontwikkelt als gevolg van de verschillen in de reactie van de vervorming van de EVL en de dooier cytoplasmatische laag (YCL) naar de isotrope actomyosine samentrekking van de E-YSL cortex is essentieel voor de directionele netto verplaatsing van de EVL en epiboly progressie1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier laten we zien dat de materiële eigenschappen en sommige biomechanische parameters van de zebravis dooier cel tijdens de epiboly worden gemakkelijk door AFM en nanodeeltjes microrheology geschat kunnen.
Terwijl AFM heeft gewerkt om op te halen van de reologische eigenschappen van cellen en weefsels in fysiologische omstandigheden4,5,25,28, ontwikkelde hier we ee…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Amayra Hernández-Vega en Philippe-Alexandre Pouille voor deelname aan het opzetten van de basis voor deze protocollen. Wij danken ook de Molecular Imaging Platform van de IBMB-PCB, Xavier Esteban en leden van het laboratorium voor continue ondersteuning. De geconsolideerde groepen programma van de Generalitat de Catalunya en de DGI en de subsidies van de Consolider van het ministerie van economie en de concurrentiekracht van Spanje voor EMB en DN ondersteund dit werk.
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
Referências
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish — all just about adhesion?. Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
