斑马鱼胚胎卵黄细胞中的 AFM 和 Microrheology
Summary
缺少用于测量材料属性和拉伸参数的工具在体内可防止在开发过程中验证它们的角色。我们使用原子力显微镜 (AFM) 和纳米粒子跟踪来量化外包期间完整的斑马鱼胚胎卵黄细胞的机械特性。这些方法是可靠的, 广泛适用于避免介入干预。
Abstract
阐明影响组织演变的时空组织的因素是发展研究的主要目的之一。各种命题在不同的发育和形成过程中对其时空组织中细胞和组织的力学性质的理解有重要的贡献。然而, 由于缺乏可靠和容易接近的工具来测量材料的性质和张力参数在体内, 验证这些假设是困难的。在这里, 我们提出的方法采用原子力显微镜 (AFM) 和粒子跟踪的目的是量化的力学性能的完整斑马鱼的胚胎卵黄细胞在外包。外包是一个早期保守的发展过程, 其研究是由胚胎的透明度促进。这些方法是简单的实施, 可靠, 广泛适用, 因为他们克服侵入性干预, 可能影响组织力学。一个简单的策略, 用于安装标本, AFM 记录, 和纳米粒子注射和跟踪。这种方法可以很容易地适应其他发育时期或生物体。
Introduction
生物力学控制形成过程的物理原理在很大程度上是没有定义的。虽然生物力学研究在分子和细胞水平正在积聚相当大的动量, 生物力学参数的探索在组织/有机体水平是在它的初期阶段。流体力学回归1或视频力显微镜2允许研究人员区分主动和被动的力量, 而激光显微手术3, 或较少侵入原子力显微镜 (AFM) 的离解细胞4或在体内5或纳米粒子 microrheology6允许对组织的机械性能和响应进行预测。
AFM 是一个三维的地形技术, 具有高的原子分辨率, 解决表面粗糙度和遵守从悬臂尖端的挠度后, 与探测表面7。采用 AFM 的不同方法来研究表面性质, 包括测量摩擦、附着力和不同材料的粘弹性特性。最近, AFM 已成为一个强大的工具, 以获取信息的机械性能的生物样品。特别是, AFM 可以性提取复杂的剪切模量从单一的细胞应用振荡凹痕与微尖端连接到一个已知的弯曲常数8。这让我们推断出产生的力。然而, AFM 不是唯一的, 不同的方法可以从单个细胞中提取流变数据和机械特性 (例如,微吸入9, 磁扭式细胞仪 (MTC)10, 或单轴拉伸测试11)。
然而, 这些新方法在复杂的形态发生过程中的应用并不简单。在确定胚胎组织的机械性能时所面临的主要挑战是小 (µm 至 mm), 软 (在 102 -104 Pa 范围) 和粘弹性 (引起时间依赖性现象) 的性质的材料12。因此, 重要的是要调整的方法, 以确定机械性能 (刚度, 粘度, 粘附) 的具体情况下, 胚胎和发展中的有机体。在分析研究发展的流变学方法时, 需要考虑两个重要的问题: 避免侵入性干扰, 并提供易于获取。在这种情况下, 微的愿望, MTC, 和拉伸试验展览的限制。在第一种情况下, 细胞遭受的高变形可能改变它的生理和机械特性9。在第二种情况下, 需要坚定地坚持实验组织的基板, 以确保施加的应力变形的骨架局部也可以引入影响细胞的活化状态, 因此, 在其机械特性10.最后, 单轴拉伸方法受发育生物体的几何和可达性11的限制。
AFM 似乎更适合于研究发展过程, 因为它允许研究生物样品直接在他们的自然环境, 没有任何繁琐的样品准备。此外, 由于胚胎组织的离解通常是困难的, 减少的原子力显微镜探头的尺寸提供了高度的通用性, 在选择介质 (水或非水滴), 样品温度或化学物质的类型上没有限制。样品的组成。AFM 具有足够的通用性, 可以应用于大的领域和时间尺度, 并被用来检索不同发育阶段或生理条件下组织的物质特性。整个原生组织, 如动脉13或骨骼的14已从地形角度进行了研究, 在某些情况下, 如巩膜, 机械性能也被检索15。在爪16的活体胚胎中也探索了地形, 允许可视化, 例如在形态发生过程中细胞重排。最后, 开发了全面的样品制备规程, 以确定不同发育过程中的力学参数。压的地图已经生成的小鸡胚胎消化道的本地无固定组织切片11;从 gastrulating 斑马鱼胚胎中分离出的单个外胚层、胚层和内胚层祖细胞的胶粘剂和力学性能4;禽胚外植体叶和原始条纹的刚度测量17;在爪5的胚脑中直接定义的一种明显的刚度梯度模式。
应用 AFM 探索胚胎发育的一个重要的质的飞跃可能来自于简单的容易接近的形态发生过程。斑马鱼外包是一个重要的和保守的事件, 其中不同的组织协调在一个限制的球形空间, 以指导扩大胚在几个小时。在斑马鱼外包 (球形阶段), 表面层的细胞, 包围层 (EVL), 涵盖了半帽的卵中心的动物极点坐在一个巨大的卵黄合胞细胞。外包包括 EVL 的皮质植物病房扩张, 胚的深细胞 (DCs), 和蛋黄周围的合胞卵黄细胞 (e-YSL) 的外层。外包结束与 EVL 和 DCs 在植物极点18,19,20。在外包期间如何以及在何处生成力以及它们是如何进行全局耦合的还不清楚1,21。
在这里, 我们详细地描述了如何应用 AFM 在斑马鱼卵黄细胞的外包进展中推断被动的机械组织特性在体内。为此, 我们采用了小微球连接到 AFM 悬臂作为探针。这允许在不均匀的卵黄细胞表面上检索精确的局部信息, 并研究拉伸梯度及其随时间变化的动态。替代 AFM 方法, 如那些使用楔形悬臂22, 将不会呈现足够精确的本地数据。楔形技术, 需要非常仔细的操作技巧, 以胶水楔形大于样本大小在悬臂底, 不太适合探测胚胎 (〜2倍大于悬臂的长度) 力学。
用定性和定量的方法对细胞的粘弹性特性进行建模和表征, 可以提高对其生物力学的认识。从生物力学的角度来看, 必须了解外包, 而不仅仅是要求知识的皮层张力测量和动力学, 可以提取的 AFM;因此需要关于组织的生物物理特性的信息。为了提取这些信息, 在不同的生理条件下, 为了刻画不同的细胞类型, 我们已经开发了各种细胞流变学技术23。它们包括 AFM、MTC 和光学镊子 (OT)。然而, 这些方法在胚胎或器官的尺度上被证明不足以进行介观分析。作为替代, 我们已经成功地适应了纳米粒子跟踪 microrheology6的体内流变测量。该技术分析了单个粒子的布朗位移, 推导了局部微机械特性。
原子力显微镜和纳米粒子 microrheology 允许定义的皮层张力动力学和内部力学性质的蛋黄在外包。这一信息完全赞同一个模型, 其中各向异性的应力发展的结果的差异, EVL 和卵黄细胞质层 (共青团) 的变形反应, 以各向同性动收缩的 e-YSL 皮层是必不可少的EVL 和外包进程的定向网移动1。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文通过 AFM 和纳米粒子 microrheology, 研究了斑马鱼卵黄细胞在外包中的物质特性和生物力学参数。
在生理条件下, afm 被用来检索细胞和组织的流变学特征4,5,25,28, 这里我们开发了一个应用 afm 的协议, 用于完整的开发我们使用的胚胎在外包期间测试斑马鱼胚胎的卵黄细胞表面。
…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Amayra 埃尔南德斯和菲利普-亚历山大 Pouille 参与建立这些协议的基础。我们还感谢 IBMB 的分子成像平台, 泽维尔伊斯特班和实验室成员的持续支持。加泰罗尼亚自治区加泰罗尼亚和 dg 的联合小组方案以及西班牙经济部和竞争力向教统局和 DN 提供的 Consolider 赠款支持了这项工作。
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
Referências
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish — all just about adhesion?. Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
