AFM и микрореологию в ячейке желток Zebrafish эмбриона
Summary
Отсутствие инструментов для измерения свойств материала и растягивающих параметров в vivo предотвращает проверку их роли в процессе разработки. Мы использовали атомно-силовой микроскопии (АСМ) и наночастиц отслеживание для количественного определения механических функций на cell желток нетронутыми zebrafish эмбриона во время epiboly. Эти методы являются надежными и широко применимые, избегая интрузивных мер.
Abstract
Изучение факторов, которые направляют пространственно временной организации развиваются тканях является одной из основных целей в изучении развития. Различные предложения утверждают, что были важный вклад в понимание механических свойств клеток и тканей в их пространственно-временных Организации в различных процессах развития и морфогенетических. Однако из-за отсутствия надежных и доступных инструментов для измерения свойств материала и растягивающих параметров в естественных условиях, проверка эти гипотезы был сложной. Здесь мы представляем методы, используя атомно-силовой микроскопии (АСМ) и частица отслеживания с целью количественного определения механических свойств ячейки желток нетронутыми zebrafish эмбриона во время epiboly. Epiboly является ранних сохранившихся процесс развития которого исследование способствует прозрачности эмбриона. Эти методы являются простым в реализации, надежный и широко применимым, поскольку они преодолеть интрузивных мер, которые могут повлиять на ткани механика. Простая стратегия применяется для монтажа образцов, AFM записи и наночастиц инъекции и отслеживания. Этот подход делает эти методы легко адаптируется для других развития раз или организмов.
Introduction
Физические принципы, лежащие в основе биомеханических контроля морфогенетических процессов являются во многом неопределенными. Хотя биомеханических исследований на молекулярном и клеточном уровне собирают значительный импульс, исследованию биомеханических параметров на уровне ткани/организм находится в зачаточном состоянии. Гидродинамические регрессии1 или видео силу микроскопии2 позволяют исследователям различать активные и пассивные силы, во время лазерной микрохирургии3или менее навязчивым атомно-силовой микроскопии (АСМ) диссоциированных клетки4 или в естественных условиях 5 или наночастиц микрореологию6 позволяют в преддверии механических свойств ткани и ответы.
AFM является трехмерных топографических техника с высоким разрешением атомной, шероховатости поверхности и соблюдение от отклонения кантилевера советы после контакта поверхности исследуемого7. Различные методики, используя AFM были разработаны для изучения свойств поверхности, включая измерения трения, силы сцепления и вязкоупругие свойства различных материалов. Недавно AFM стала мощным инструментом для получения информации о механических свойствах биологических образцов. В частности AFM неинвазивно можно извлечь модуль сдвига комплекс из единичных клеток путем применения колебательных отступы с микро Совет придает консольные известных изгиб постоянной8. Это позволяет нам выводить результирующие силы. Тем не менее, АСМ не является уникальным и разные методики позволяют извлечение данных реологических и механические свойства из отдельных клеток (например, микропипеткой стремление9магнитные скручивания цитометрии (MTC)10, или Одноосное растяжение Тестирование11).
Тем не менее применение этих новых методологий для сложных морфогенетических процессов не проста. Основные проблемы при определении механических свойств эмбриональных тканей являются малые (мкм до мм), мягкие (в 102 – 10-4 ПА диапазона) и вязко упругие (приводящее к возникновению явлений время зависимых) характер материала12. Поэтому важно адаптировать методы, используемые для определения механических свойств (жесткость, вязкость, адгезия) в конкретном случае эмбрионы и развивающихся организмов. Два важных вопросов необходимо учитывать при анализе реологических подходы к изучению развития: чтобы избежать навязчивой вмешательства и обеспечить доступность. В этом случае микропипеткой аспирации, MTC и испытания на растяжение выставлять ограничения. В первом случае высокой деформации, что страдает ячейки могут изменить его физиологические и механические свойства9. Во втором случае необходимо твердо придерживаться экспериментальной ткани к подложке для обеспечения, что подчеркивает применяется деформироваться цитоскелета локально предусмотреть также воздействие на состояние активации клеток и, следовательно, их механические характеристики10 . Последний, Одноосное растяжение подходов ограничиваются геометрии развивающихся организмов и доступность11.
AFM, кажется, быть лучше подходят для изучения процессов развития, как изучение биологических образцов позволяет непосредственно в их естественной среде без каких-либо обременительных пробоподготовки. Кроме того как диссоциации эмбриональных тканей как правило, трудно, уменьшение размера АСМ зондов обеспечивает высокую степень универсальности без ограничения в выборе типа среднего (водный или безводным), температура образца или химического состав выборки. AFM достаточно универсален, чтобы применяться в больших доменах и времени весы и был нанят для извлечения свойств материала тканей в различные этапы развития или физиологических условиях. Всей родной тканей такие как артерий13 или кости14 были изучены с точки зрения топографических и в некоторых случаях, как склеры, механические свойства были также проверено15. Топография была также изучена в живой эмбрионов, позволяя визуализации, например, клетки перегруппировки в ходе морфогенеза в Xenopus16. Последние, всеобъемлющие образца подготовка протоколов были разработаны для определения механических параметров в ходе различных процессов развития. Наноиндентирование карты были созданы на родной незаписанных тканей секции для Чик эмбриональных пищеварительного тракта11; клей и механических свойств, извлекаемых для отдельных ячеек прародитель эктодермы, мезодермы и энтодермы изолированы от gastrulating zebrafish эмбриона4; жесткость измерений для Эпибласт и примитивных полоска на эксплантов от птичьего эмбрионов17; и собственный шаблон жесткость градиенты непосредственно определен в эмбриональных мозга Xenopus5.
Значительный качественный скачок для применения AFM для изучения развития эмбриона может исходить от приближается к простой доступной морфогенетических процессов. Данио рерио epiboly является важным и сохраняется событие, в котором различные ткани координировать в ограниченном пространстве сферических прямого расширения бластодермы в течение нескольких часов. В начале данио рерио epiboly (сферические этап) поверхностный слой клеток, обволакивающий слой (EVL), охватывает полусферических Кап бластомеров сосредоточены на животное полюс сидя на массивных желток-синцитиальный клеток эмбриона. Epiboly состоит из кортикального слоя растительного Уорд расширения EVL, глубокие клетки (DCs) бластодерма, и наружный слой клеток-синцитиальный желток (E-YSL) вокруг желтка. Epiboly концы с закрытием EVL и DCs на19,18,растительных полюса20. Как и где силы создаются во время epiboly, и как они соединены в глобальном масштабе не ясно еще1,21.
Здесь мы подробно описать как применять AFM заключить, что свойства пассивной механических тканей во время epiboly прогрессии в желтке данио рерио ячейки в естественных условиях. Сделать это, мы используем небольшие микросферы, придает AFM кантилеверы как зонды. Это позволяет поиск точных местной информации в пределах желток неоднородной поверхности клетки и учиться напряжённая градиентов и их динамику с течением времени. Альтернативные AFM подходы например, с использованием клин кантилеверы22, будет не визуализации локальных данных, который является достаточно точным. Клин технику, которая требует очень тщательного манипуляции навыки клеить клин больше, чем размер выборки в конце кантилевера, не хорошо подходит для исследования эмбриона (~ 2 раза больше, чем длина консольные) механика.
Моделирование и характеризующие вязкоупругие свойства клеток в качественном и количественном отношениях позволяет для более глубокого понимания их биомеханики. С биомеханической точки зрения важно, чтобы понять epiboly, а не только спрос знание корковых напряжения измерения и динамики, которые могут быть извлечены AFM; Таким образом, существует потребность в информации о биофизических свойствах ткани. Для получения этой информации, различных методов реологические свойства ячейки были разработаны с годами для характеристики различных типов клеток при различных физиологических условиях23. Они включают в себя AFM, MTC и Оптический пинцет (OT). Эти методы, однако, как было доказано недостаточно для анализа мезоскопических в масштабе эмбрионов или органов. В качестве альтернативы мы успешно адаптировались6 наночастиц отслеживания микрореологию в vivo реологических измерений. Этот метод анализирует броуновского перемещений отдельных частиц и выводит местных микромеханические свойства.
Вместе AFM и наночастиц микрореологию позволяют определение динамики корковых растягивающих и внутренних механических свойств желток во время epiboly. Эта информация полностью поддерживает модель, в котором анизотропной стресс развивается вследствие различий в ответе деформации EVL и желток цитоплазматических слой (коммунистической) к сужению изотропной actomyosin E-YSL коры имеет важное значение для направленного движения чистой EVL и epiboly прогрессии1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы покажем, что свойства материала и некоторые биомеханические параметры данио рерио желток ячейки во время epiboly может быть легко оценены AFM и наночастиц микрореологию.
В то время как AFM был нанят для получения реологических характеристик клеток и тканей в физиолог?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Amayra Эрнандес-Вега и Филипп-Александр Пуй за участие в создании основы для этих протоколов. Мы также благодарим молекулярной визуализации платформы от IBMB-PCB, Xavier Эстебан и члены лаборатории для непрерывной поддержки. Сводной группы программа Женералитата Каталонии и DGI и Consolider грантов от министерства экономики и конкурентоспособности Испании наб и DN поддерживает эту работу.
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
Referências
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish — all just about adhesion?. Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
