AFM og Microrheology i cellen zebrafisk Embryo æggeblomme
Summary
Manglen værktøjer til at måle materialeegenskaber og tensional parametre i vivo forhindrer validering deres roller under udvikling. Vi ansat atomic force mikroskopi (AFM) og nanopartikel-tracking til at kvantificere mekaniske funktioner på intakt zebrafisk embryo æggeblomme celle under epiboly. Disse metoder er pålidelig og bredt anvendelig, undgå indgribende indgreb.
Abstract
Belyse de faktorer, der direkte spatio-temporale organisationen af skiftende væv er en af de primære formål i studiet af udvikling. Forskellige udsagn hævder at have været vigtige bidrag til forståelsen af de mekaniske egenskaber af celler og væv i deres spatiotemporelle organisation i forskellige udviklingsmæssige og morfogenetiske processer. På grund af manglende pålidelige og tilgængelige værktøjer til at måle materialeegenskaber og tensional parametre i vivo, har validering af disse hypoteser imidlertid været svært. Her præsenterer vi metoder beskæftiger atomic force mikroskopi (AFM) og partikel sporing med formålet at kvantificere de mekaniske egenskaber af intakt zebrafisk embryo æggeblomme celle under epiboly. Epiboly er en tidlig bevarede udviklingsproces hvis undersøgelse er lettet af gennemsigtighed af embryoet. Disse metoder er enkle at gennemføre, pålidelige og bredt gældende da de overvinde indgribende indgreb, der kan påvirke væv mekanik. En simpel strategi blev anvendt til montering af enheder, AFM optagelse og nanopartikel injektioner og sporing. Denne tilgang gør disse metoder let at tilpasse til andre udviklingsmæssige gange eller organismer.
Introduction
De fysiske principper den biomekaniske kontrol af morfogenetiske processer er i vid udstrækning udefineret. Mens biomekaniske studier på det molekylære og cellulære niveau er ved at samle betydelige momentum, er udforskning af biomekaniske parametre på væv/organisme niveau på begynderstadiet. Hydrodynamisk Regression1 eller Video kraft mikroskopi2 giver forskere til at skelne mellem aktiv og passiv kræfter, mens laser mikrokirurgi3, eller den mindre indgribende atomic force mikroskopi (AFM) af dissocierede celler4 eller i vivo 5 eller nanopartikel microrheology6 tillade foregribelse af et væv mekaniske egenskaber og svar.
AFM er en tre-dimensionel topografisk teknik med høj atomic opløsning løse overfladeruhed og overholdelse fra indbøjningen af cantilever tips ved kontakt med en probed overflade7. Forskellige metodikker beskæftiger AFM er blevet udviklet for at undersøge overflade egenskaber, herunder måling af friktion, vedhæftning styrker og viskoelastiske egenskaber af forskellige materialer. For nylig, AFM fremstod som et kraftfuldt værktøj til at hente oplysninger om de mekaniske egenskaber af biologiske prøver. AFM kan navnlig ikke-invasivt uddrag komplekse shear modulus fra enkelte celler ved at anvende oscillerende fordybninger med micro spids knyttet til en cantilever kendte bøjning konstant8. Dette lader os udlede resulterende kræfter. Endnu, AFM er ikke entydigt og forskellige metoder giver mulighed for udtrække rheologiske data og mekaniske egenskaber fra enkelte celler (fx mikropipette aspiration9, magnetiske vride flowcytometri (MTC)10, eller enakset trækstyrke test11).
Men anvendelsen af disse nye metoder til komplekse morfogenetiske processer er ikke ligetil. De vigtigste udfordringer ved fastsættelsen af de mekaniske egenskaber af embryonale væv er små (µm til mm), soft (i 102 – 104 Pa range) og viskoelastisk (giver anledning til tidsafhængig fænomener) arten af de materielle12. Det er derfor vigtigt at tilpasse metoderne til bestemmelse af mekaniske egenskaber (stivhed, viskositet, vedhæftning) til det specifikke tilfælde af embryoner og udvikle organismer. To vigtige spørgsmål skal tages i betragtning når du analyserer rheologiske tilgange til at studere udvikling: at undgå forstyrrende indgriben og give let tilgængelighed. I dette scenario udstille mikropipette aspiration, MTC og trækstyrke test begrænsninger. I det første tilfælde, den høje deformation, som en celle lider måske ændre dens fysiologiske og mekaniske egenskaber9. I det andet tilfælde, kunne behovet for at fast overholder den eksperimentelle væv til et substrat til at sikre, at de understreger anvendes deformere cytoskeleton lokalt også indføre effekter på cellerne aktiveringstilstanden og dermed, i deres mekaniske egenskaber10 . Sidste, enakset trækstyrke tilgange er begrænset af geometri for at udvikle organismer og tilgængelighed11.
AFM synes at være bedre egnet til undersøgelse af udviklingsprocesser, da det giver mulighed for undersøgelse af biologiske prøver direkte i deres naturlige miljø uden besværlig prøveforberedelse. Desuden, som dissociation af embryonale væv er generelt vanskeligt, reduceret størrelsen af AFM sonder giver en høj grad af alsidighed med ingen begrænsninger i valget af typen medie (enten vandig eller ikke-vandige), prøve temperatur eller kemiske sammensætningen af stikprøven. AFM er alsidig nok til at anvendes til store domæner og tid skalaer og har været ansat til at hente materiale egenskaber af væv i forskellige udviklingsstadier eller fysiologiske forhold. Hele indfødte væv såsom arterier13 eller knogler14 er blevet undersøgt fra en topografiske synspunkt og i nogle tilfælde, ligesom sclera, mekaniske egenskaber også har hentet15. Topografi er også blevet undersøgt i levende embryoner tillade visualisering af, for eksempel, celle omlejring under morfogenese i Xenopus16. Sidste, omfattende stikprøve forberedelse protokoller er blevet udviklet for at bestemme mekaniske parametre under forskellige udviklingsprocesser. Nanoindentation kort er blevet genereret på native ikke optagne væv sektioner for chick embryonale fordøjelseskanalen11; lim og mekaniske egenskaber hentes til individuelle ectoderm, mesoderm og endoderm stamceller isoleret fra gastrulating zebrafisk embryoner4; stivhed målinger udført for epiblast og primitivstriberne på explants fra aviær embryoner17; og en særskilt mønster af stivhed forløb direkte defineret i embryonale hjernen Xenopus5.
Et betydeligt kvalitetsløft for at anvende AFM for at udforske fosterudviklingen kan komme fra nærmer sig simpel tilgængelige morfogenetiske processer. Zebrafisk epiboly er et vigtigt og bevarede begivenhed, hvor forskellige væv koordinere i en begrænset sfæriske rum til direkte ekspansion af blastoderm i et par timer. Ved starten af zebrafisk epiboly (sfæriske etape) dækker en overfladiske lag af celler, det omsluttende lag (EVL), en halvkugleformet hætte af blastomeres centreret om dyret pole embryoets sidder på en massiv æggeblomme syncytial celle. Epiboly består af kortikale vegetabilsk ward udvidelse af EVL, de dybe celler (DCs) af blastoderm, og det ydre lag af cellen syncytial æggeblomme (E-YSL) omkring æggeblomme. Epiboly slutter med lukningen af EVL og DCs på vegetal pole18,19,20. Hvordan og hvor styrker genereres under epiboly og hvordan de er globalt kombineret er endnu ikke klart1,21.
Her beskriver vi i detaljer hvordan man kan anvende AFM for at udlede passiv mekaniske væv egenskaber under epiboly progression i zebrafisk æggeblomme celle i vivo. Det gør ansat vi lille mikrokugler knyttet til AFM udkragninger som sonder. Dette tillader hentning af præcise lokale oplysninger inden for uensartet æggeblomme celleoverfladen og til at studere tensional forløb og deres dynamik over tid. Alternative AFM tilgange såsom dem, der bruger kile udkragninger22, vil ikke render lokale data, der er præcise nok. Kile teknik, som kræver en meget omhyggelig manipulation færdigheder til at lime en kile større end stikprøvestørrelse for enden af cantilever, er ikke velegnet til sondering embryo (~ bukkes 2 gange større end længden af cantilever) mekanik.
Modellering og karakterisering viskoelastiske egenskaber af celler i kvalitative og kvantitative metoder giver mulighed for en bedre forståelse af deres biomekanik. Fra en biomekanisk synspunkt er det vigtigt at forstå epiboly, og ikke bare efterspørgsel viden om kortikale spænding målinger og dynamik, som kan udvindes af AFM; der er således behov for oplysninger om de biofysiske egenskaber af væv. For at udtrække denne information, en række celle reologi teknikker er blevet udviklet gennem årene for at karakterisere forskellige celletyper under forskellige fysiologiske tilstande23. De omfatter AFM, MTC og optiske pincet (OT). Disse metoder, men har vist sig utilstrækkelig mesoskopisk analyser på omfanget af embryoner eller organer. Som et alternativ, har vi med succes tilpasset nanopartikel-tracking microrheology6 i vivo rheologiske målinger. Denne teknik analyserer de Brownske fordrivelse af enkelte partikler og udleder lokale micromechanical egenskaber.
Sammen AFM og nanopartikel microrheology tillade definition af kortikale tensional dynamik og indre mekaniske egenskaber af blommesækken under epiboly. Denne information støtter fuldt ud en model hvor anisotrope stress udvikler som følge af forskelle i deformation svar af EVL og den æggeblomme cytoplasmatisk lag (YCL) til isotropic actomyosin sammentrækning af E-YSL cortex er afgørende for retningsbestemt netto flytning af EVL og epiboly progression1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi, at de materialeegenskaber og nogle biomekaniske parametre af zebrafisk æggeblomme celle under epiboly kan skønnes let ved hjælp af AFM og nanopartikler microrheology.
Mens AFM har været ansat til at hente rheologiske egenskaber i celler og væv i fysiologiske forhold4,5,25,28, udviklede her vi en protokol til AFM for intakt udvikle embryoner, der vi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Amayra Hernández-Vega og Philippe-Alexandre Pouille for at deltage i oprettelsen af grundlaget for disse protokoller. Vi takker også den molekylære billeddannelse Platform fra IBMB-PCB, Xavier Esteban og medlemmer af laboratoriet for løbende support. Programmet konsoliderede grupper af Generalitat de Catalunya og DGI og Consolider tilskud fra ministeriet for økonomi og konkurrenceevne i Spanien til EMB og DN støttet dette arbejde.
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
Referências
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish — all just about adhesion?. Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
