Enclenchez la puce pour les immunoessais de Cross-reactivity-libre et exempt de Spotter multiplexée "sandwich"
Summary
Nous démontrons une technologie de puce snap pour effectuer des tests immunologiques reactivity-free multiplexée “sandwich” le simplement claquer deux diapositives. Un appareil à pression est utilisé pour le transfert fiable des réactifs de microarray-aux-puces. La puce du composant logiciel enfichable peut être utilisée pour des réactions biochimiques nécessitant une colocalisation des différents réactifs sans contamination croisée.
Abstract
Analyse des protéines multiplexé a montré la sensibilité diagnostique supérieure et la précision par rapport aux protéines simples. Microarrays d’anticorps permettent depuis des milliers d’immunoessais micro-échelle réalisées simultanément sur une seule puce. Format de dosage “sandwich” améliore la spécificité de dosage en détectant chaque cible avec deux anticorps, mais souffre d’une réactivité croisée entre les réactifs limitant ainsi leurs capacités de multiplexage. Anticorps colocalisation microarray (ACM) a été développé pour la détection de protéines multiplexé cross-reactivity-libre, mais requiert un pareur cher sur place pour la fabrication de puces lors des essais. Dans ce travail, nous démontrons une technologie de puce de composant logiciel enfichable qui transfère le réactif de microarray-aux-puces de simplement claquer deux puces ensemble, que donc aucun pareur n’est nécessaire au cours de l’incubation de l’échantillon et la demande ultérieure d’anticorps de détection (dAbs) sur stockage de diapositives pré tachetés, se dissociant de la préparation de l’exécution de test. Les deux méthodes de transfert de simples et doubles sont présentés pour parvenir à un alignement précis entre les deux puces à ADN et la fabrication de diapositives pour les deux méthodes sont décrites. Les résultats montrent que < 40 μm alignement a été réalisé avec le double transfert, pour atteindre une densité de tableau de 625 points/cm2. Un test immunologique 50-plexed a été mené pour démontrer la facilité d’utilisation de la puce de composant logiciel enfichable dans l’analyse des protéines multiplexé. Limites de détection des 35 protéines sont dans la gamme de pg/mL.
Introduction
Un panel de biomarqueurs comprenant plusieurs protéines peut fournir plus de sensibilité et de spécificité qu’un biomarqueur unique pour le diagnostic de maladies complexes telles que les cancers1,2. Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) a été l’étalon-or technologie utilisée dans les laboratoires cliniques, atteindre une limite de détection à faible pg/mL dans le plasma, mais les limites à une cible par dosage3,4,5. Microarrays d’anticorps ont été conçus pour accueillir des milliers de tests miniaturisés effectuées en parallèle sur un microscope unique diapositive6,7,8. Toutefois, la capacité de multiplexage de cette méthode est limitée par la réactivité croisée pilotée par le réactif, résultant de l’application d’un mélange de limandes, et elle devient plus problématique avec un nombre croissant de cibles9,10 , 11. Pla et al. ont déclaré que la vulnérabilité résultante d’un essai de multiplex “sandwich” échelles comme 4N(N-1), où N est le nombre des cibles12.
Pour atténuer les réactions croisées en anticorps microarrays, anticorps colocalisation microarray (ACM) a été développé dans notre laboratoire pour multiplex “sandwich” test12. Anticorps de capture (cabines) sont repérés sur un substrat avec un guetteur de microarray. Après blocage échantillons sont appliqués sur la surface, et puis par les touches individuelles sont repérés sur les mêmes endroits avec le complexe antigène-cAb. Tous les scénarios de réactivité croisée entre les anticorps et les antigènes peuvent être atténués avec ACM, et limites de détection à pg/mL ont été atteints. Toutefois, le protocole d’essai nécessite préparation et repérer les touches au cours des expériences à l’aide d’un pareur de microarray sur place avec une grande précision pour fins d’alignement, qui est coûteux et prend du temps, de limiter l’application large de cette technologie dans autres laboratoires. Un ordinateur de poche ACM, nommé puce clin d’oeil a été développé pour cross-reactivity-libre et exempt de spotter multiplex “sandwich” immunoessais13,14,15. toutes les cabines et plots sont préalablement repérées sur une diapositive de dosage et un toboggan de transfert respectivement au format de microarray et stockés. Pendant le test, les diapositives sont récupérées et un microarray des plots sont transférés collectivement sur le toboggan de dosage à simplement faire claquer les deux puces ensemble. Un appareil à pression est utilisé pour transfert fiable de réactif. Diapositives de nitrocellulose enduit avec une capacité de liaison anticorps relativement importantes ont été utilisés comme les diapositives de dosage pour absorber les gouttes de liquides et ainsi faciliter le transfert de réactif, cependant, les diapositives sont plus chers que microarray et lames de verre ordinaire scanners compatibles avec lames opaques sont nécessaires pour l’acquisition de signaux.
Dans ce travail, nous démontrons le protocole d’exécution d’un test immunologique du multiplex “sandwich” avec un clin d’oeil à puce. Un appareil nouveau clin d’oeil a été développé pour le transfert de réactif plus pratique et fiable de microarray-aux-puces. Ce qui est important, ici, nous avons établi la méthode de transfert de réactif sur lames de verre ordinaire avec la puce de composant logiciel enfichable. 1024 points ont été correctement transférés et alignés sur une lame de verre, élargissant considérablement l’utilisation de cette technologie dans la plupart des laboratoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, nous avons présenté une technologie de puce de clin d’oeil qui rend les immunoessais cross-reactivity-libre multiplexes largement disponibles pour les chercheurs avec base montage expérimental. Différent des puces à anticorps existant, aucun observateur « microarray » n’est nécessaire pour les utilisateurs finaux. Les single et double les méthodes de transfert sont démontrés, et double transfert offre précision d’alignement supérieur vers le bas pour ~ 40 μm pour les taches de 98 %,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Rob Sladek pour l’utilisation de la longue-vue de jet d’encre. Nous reconnaissons le support final des instituts de recherche en santé (ICRS), sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG), l’Institut canadien de la recherche sur les société de Cancers et la Fondation canadienne pour l’Innovation (FCI). D.J. Merci de soutien d’une Chaire de recherche du Canada.
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
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