Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap
Summary
Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.
Abstract
Çoğaltılmış protein analizi üstün tanılama hassasiyet ve doğruluk için tek proteinler karşılaştırıldığında göstermiştir. Antikor microarrays aynı anda tek bir yonga üzerinde gerçekleştirilen mikro ölçekli uzun binlerce sağlar. Sandviç tahlil biçimi her hedef iki antikorlar ile tespit ederek tahlil özgüllük artırır, ancak böylece çoğullama yeteneklerini sınırlayan reaktifler arasında olan muzdarip. Antikor colocalization Mikroarray (ACM) çoğaltılmış protein çapraz-reactivity ücretsiz algılama için geliştirilmiştir, ancak pahalı bir gözcü yerinde Mikroarray imalat deneyleri sırasında için gerektirir. Bu çalışmada, biz sadece dayama iki fiş birlikte, böylece hiçbir gözcü örnek kuluçka ve algılama antikor (dAbs) sonraki uygulama sırasında gerekli tarafından Mikroarray Mikroarray reaktif aktarır bir ek çip teknolojisi göstermek depolama öncesi benekli slayt, slayt hazırlama tahlil yürütme dissociating. Her iki tek ve Çift Kişilik transfer yöntemleri iki microarrays arasında doğru uyum elde etmek için sunulmaktadır ve slayt imalat yöntemleri açıklanmıştır. Sonuçları gösteriyor ki < 40 mikron hizalama 625 noktalar/cm2bir dizi yoğunluğu ulaşan Çift Kişilik transferi ile elde. 50-plexed immunoassay çoğaltılmış protein analizi ek yongasında kullanılabilirlik göstermek için yapılmıştır. Sınırlar 35 proteinlerin algılama aralığı pg/mL vardır.
Introduction
Birden fazla protein oluşan biyolojik bir panel daha yüksek duyarlılık ve özgüllük kanserleri1,2gibi karmaşık hastalıkların tanısında tek bir biyomarker daha sağlayabilir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) klinik laboratuvarlar bir limit düşük pg/mL plazma, algılama, ama sınırları tahlil3,4,5başına bir hedefe ulaşmada kullanılan altın standart teknoloji olmuştur. Paralel bir tek mikroskop slayt6,7,8bin-in küçültülmüş deneyleri accomodating yürütülen için antikor microarrays geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemin çoğullama yeteneği parmak izleri, karışımı uygulamadan kaynaklanan reaktif tahrik olan ile sınırlıdır ve hedefleri9,10 giderek artan sayıda daha sorunlu hale gelir , 11. Pla ve ark. Sonuçta ortaya çıkan güvenlik açığı bir multiplex sandviç testin hedefleri12numarası N olan 4N(N-1) ölçekler belirttiler.
Antikor microarrays, antikor colocalization Mikroarray olan etkisini azaltmak için (ACM) bizim laboratuvar multiplex sandviç tahlil12için geliştirilmiştir. Yakalama antikorlar (taksi) bir substrat Mikroarray gözcü ile tespit. Sonra engelleme örnekleri yüzeye uygulanır ve sonunda bireysel dAbs taksi-antijen kompleksi aynı noktalar üzerinde gördü. Antikorlar antijenleri arasındaki tüm olan senaryoları ACM ile azaltılabilir ve algılama pg/mL, sınırlarını elde ettik. Ancak, tahlil Protokolü hazırlama ve bir yerinde Mikroarray gözcü yüksek hassasiyetle pahalı ve zaman alıcı hizalama amaç için kullanarak, bu teknoloji içinde geniş uygulama sınırlama deneyler sırasında parmak izleri tespit gerekir diğer laboratuvarlar. Ek çip adında bir el ACM için çapraz-reactivity ücretsiz geliştirilmiştir ve gözcü-Alerjik multiplex sandviç uzun13,14,15. Kabinler ve parmak izleri bir tahlil slayt ve sırasıyla Mikroarray biçiminde bir transfer slayt üzerine önceden tespit ve depolanır. Tahlil sırasında slaytlar alınır ve dAbs Mikroarray aktarılır topluca tahlil slayt sadece birlikte iki fiş şaklatarak. Bir ek aparatı güvenilir reaktif aktarımı için kullanılır. Nispeten büyük antikor Bağlama kapasitesi ile kaplı nitroselüloz slaytlar sıvı damlacıkları emmek için tahlil slaytlar olarak kullanılmış ve böylece reaktif transfer kolaylaştırıcı, ancak, slaytları normal cam slaytlar ve Mikroarray daha daha pahalıdır saydam olmayan slaytlar ile uyumlu tarayıcılar sinyal alımı için ihtiyaç vardır.
Bu çalışmada, multiplex sandviç immunoassay ek çip ile gerçekleştirme Protokolü göstermektedir. Bir roman ek aparatı Mikroarray Mikroarray daha rahat ve güvenilir reaktif transferi için geliştirilmiştir. Önemlisi, burada reaktif aktarma yöntemi ek çip ile normal cam slaytlar üzerine kurduk. 1024 noktalar başarıyla transfer ve bu teknolojinin en laboratuarlarında kullanımı önemli ölçüde genişleyen bir cam slayt üzerine hizalanmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, araştırmacılar ile temel deneysel kurulum için çapraz-reactivity ücretsiz multiplex uzun yaygın olarak kullanılabilir duruma getirir bir ek çip teknolojisi sunulmuştur. Varolan antikor microarrays farklı, hiçbir Mikroarray gözcü son kullanıcılar için gereklidir. Hem tek hem de çift transfer yöntemleri gösterdi ve Çift Kişilik transfer affords üstün hizalama doğruluğu aşağı ~ % 98’i lekeli 63 µm14en büyük kayma için 40 mikron. Bir roman ek aparatı …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Rob Sladek mürekkep püskürtmeli gözcü kullanım için teşekkür ederim. Sağlık Araştırma (CIHR), Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC), Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü ve Kanada Vakfı için son destek için yenilik (CFI) Kanadalı Enstitüleri üzerinden anıyoruz. DJ teşekkürler bir Kanada araştırma sandalyeden destekler.
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
Referências
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
