ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית
Summary
Oligodendrocytes להפוך Myelinating לקדם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה והישרדות עצביים. המתוארים כאן הוא פרוטוקול ספציפי אוליגודנדרוציטים ביטוי של חלבונים פלורסנט ב organotypic פרוסות המוח עם הדמיה בצילום מואץ עוקבות. עוד, מוצג הליך פשוט להמחשת המיאלין וללא רבב.
Abstract
נוירונים להסתמך על בידוד חשמלי ותמיכה עם מחלות של oligodendrocytes להפוך myelinating. למרות החשיבות של oligodendrocytes להפוך, הכלים המתקדמים בשימוש כיום ללמוד הנוירונים, רק בחלקו ננקטו חוקרי אוליגודנדרוציטים. תא ייחודיים לסוג מכתים על ידי נגיפי התמרה חושית היא גישה שימושית בחקר דינמיקה אברון בשידור חי. מאמר זה מתאר פרוטוקול להמחשת אוליגודנדרוציטים המיטוכונדריה פרוסות המוח organotypic על ידי התמרה חושית בווירוס adeno-הקשורים (AAV) נושאת גנים מיטוכונדריאלי חלבונים פלורסנט יישוב תחת שליטה תעתיק של האמרגן בסיסי חלבון המיאלין. היא כוללת את הפרוטוקול לעשיית organotypic פרוסות המוח העכבר הילתית. בעקבות הליך של הדמיה בצילום מואץ של המיטוכונדריה לאחר מכן. שיטות אלה ניתן להעביר organelles אחרים, עשוי להיות שימושי במיוחד עבור לימוד organelles נדן מיאלין. לבסוף, אנו מתארים טכניקה זמינים עבור ויזואליזציה של מיאלין מוכתם בפרוסות חי על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe). הליבה דורש אין ציוד נוסף, יכול להיות שימושי לזהות את המיאלין במהלך דימות בשידור חי.
Introduction
חומר לבן של המוח מורכב אקסונים תא העצב עטוף המיאלין, קרום פלזמה מיוחדים המורחבת הנוצרת על-ידי oligodendrocytes להפוך. המיאלין הדרושים לשם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה ואמינה ההישרדות לטווח ארוך של ו דנדריטים, איבוד המיאלין יכול לגרום לבעיות נוירולוגיות. למרות חשיבותם, מאפייני oligodendrocytes להפוך פחות ידוע מושווים עם נוירונים, האסטרוציטים. כתוצאה מכך, פותחו כלים פחות לימוד oligodendrocytes להפוך.
חיים הדמיה של האברונים כגון המיטוכונדריה, רשת endoplasmatic (ER) או מבנים vesicular שונים יכול להיות שימושי ללמוד דינאמי לשינויים organelles לאורך זמן. באופן מסורתי, בוצעה הדמיה של החיים oligodendrocytes להפוך monocultures1,2. עם זאת, oligodendrocytes להפוך ב מונוקולטורה אינם מציגים המיאלין קומפקטי ולאחר organotypic או פרוסות המוח חריפה, לכן, ייתכן אפשרות טובה יותר לומדים לוקליזציה ותנועה של organelles. לוקליזציה של organelles קטן, חלבונים נדן המיאלין יכול להיות מאתגר עקב המרחק הקצר בין סיבי העצב הפעולה באקסון למעטפת מיאלין שמסביב. לפיכך, הנהלים immunostaining מיקרוסקופיים אור לבד אין את הרזולוציה המרחבית להפלות בין organelles נדן המיאלין לבין אלה האקסון סיבי העצב. ניתן לפתור זאת על ידי נגיפי התמרה חושית עם גנים, ממוקדות אברון חלבונים פלורסנט מונע על ידי היזמים ייחודיים לסוג התא. היתרונות הם ביטוי ספציפי תא, דליל, אשר מאפשרת הערכה מדויקת של אברון לוקליזציה ואת הדינמיקה. חיות הטרנסגניים יכול לשמש גם כדי להשיג כזה של אברון, ממוקדות ביטוי ספציפי תא3. עם זאת, הייצור ואת התחזוקה של חיות הטרנסגניים יקר, בדרך כלל אינו מציע הביטוי דליל יכולה להיות מושגת על ידי שיטות ויראלי.
השיטה המתוארת כאן משתמש ויראלי התמרה חושית של oligodendrocytes להפוך עם מיטוכונדריאלי במיקוד חלבונים פלורסנט (dsred או ירוק חלבון פלואורסצנטי, GFP) מונע על ידי האמרגן חלבון בסיסי מיאלין (MBP-mito-dsred או MBP-mito-GFP) לדמיין המיטוכונדריה אוליגודנדרוציטים פרוסות המוח organotypic. בנוסף, ביטוי אחר החלבון הניאון בציטופלסמה (GFP בהם יחד עם mito-dsred או tdtomato עם mito-GFP) משמש כדי לאפשר ויזואליזציה של מורפולוגיה תאים, כולל את תאי cytoplasmic למעטפת מיאלין. הפרוטוקול כולל את ההליך להכנת פרוסות המוח organotypic (גירסה שונה של הפרוטוקול המתואר על ידי דה Simoni, יו, 20064,5). לאחר מכן נתאר את ההליך הדמיה בצילום מואץ ללמוד תנועה מיטוכונדריאלי. הליך זה משתמש מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם החלפת רציפה של המדיום הדמיה, מלכודת המאפשרת יישום קל של סמים או שינויים אחרים בינוני במהלך דימות. ההליך הדמיה בצילום מואץ יכול להתבצע על כל מיקרוסקופ קונפוקלי, עם ציוד נוסף לשמירה על החיים פרוסות כמפורט להלן. הפרוטוקול מכיל גם כמה טיפים כדי למטב את ההדמיה ולהפחית את phototoxicity.
לבסוף, מתוארת דרך מהירה ופשוטה כדי להמחיש המיאלין מוכתם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe). זה יכול להיות שימושי לזהות את המיאלין במהלך דימות בשידור חי. בשנים האחרונות, מספר טכניקות פותחו המיאלין התמונה ללא כל מכתים נדרש, אך רוב אלה דורשים ספציפי ציוד ומומחיות6,7,8. ההליך המתואר כאן משתמשת במאפיינים רעיוני של למעטפת מיאלין, היא גרסה מפושטת אורך גל יחיד-עירור של השתקפות קונאפוקלית ספקטרלי מיקרוסקופ (ציון, שבו מספר לייזר אורכי גל משולבים להמחיש מיאלין) 9. הליבה יכול להיעשות על כל מיקרוסקופ קונפוקלי 488 ננומטר לייזר ו- 470-500 ננומטר bandpass פליטה מסנן או מסנן פליטה tunable.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול להכנת organotypic תרבויות המתוארים כאן הוא הגירסה ששונתה18 של הפרוטוקול המתואר על ידי דה Simoni יו (2006)5. השינויים החשובים ביותר יש כבר המתוארים להלן. טריס מאגר נוסף המדיום תרבות, אשר משפר את ההישרדות של הפרוסות כאשר מחוץ החממה במהלך התמרה חושית ויראלית ושינוי של ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לינדה הילדגרד Bergersen ו Magnar Bjørås עבור גישה לתא מעבדה וציוד, צוות משאבים משותפים של ביולוגיה מולקולרית Janelia עבור פלסמיד והפקה וירוס, קואן Vervaeke לקבלת סיוע עם מדידות חשמל לייזר. עבודה זו מומן על ידי איגוד הבריאות נורבגי, המועצה מחקר נורבגי, הציוד מיקרוסקופ מומן על ידי Norbrain.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
Referências
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
