في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو السماح للكشف عن في فيفو قتل الخلية المستهدفة في نموذج مورين مستضد على حدة.
Abstract
المنهجيات الحالية لقتل محددة مستضد محدودة للاستخدام في المختبر أو تستخدم في نماذج الأمراض المعدية. ومع ذلك، هناك لا بروتوكول خصيصا لقياس محددة مستضد القتل دون عدوى. تم تصميم هذا البروتوكول ويصف أساليب للتغلب على هذه القيود بالسماح للكشف عن حدة مستضد قتل الخلية المستهدفة واسطة CD8+ تي الخلايا في فيفو. ويتم ذلك عن طريق دمج نموذج تطعيم بهدف المسمى كفسي تقليدية مما أسفر عن مصرع المقايسة. يسمح هذا المزيج الباحث لتقييم إمكانات CTL محددة مستضد مباشرة وبسرعة كما المقايسة لا يتوقف على نمو الورم أو الإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، قراءات يرتكز على التدفق الخلوي وهكذا ينبغي أن تكون متاحة لمعظم الباحثين. يتم تحديد القيد الرئيسي للدراسة المخطط الزمني في فيفو غير الملائمة إلى الفرضية يجري اختبارها. الاختلافات في قوة مستضد والطفرات في خلايا تي التي قد تسفر عن الدالة عن فرق بحاجة إلى أن يقيم بعناية لتحديد الوقت الأمثل للحصاد الخلية والتقييم. وقد تم تحسين تركيز مناسب من الببتيد للتطعيم hgp10025-33 والبويضات257-264، ولكن كذلك أنه يلزم التحقق من الصحة الببتيدات الأخرى التي قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة معينة. وعموما، هذا البروتوكول يسمح بتقييم سريع لقتل الدالة في فيفو ويمكن تكييفها مع أي مستضد معين.
Introduction
توجد بروتوكولات متعددة تقييم إمكانات CD8 (CTL) عن+ أو خلايا CD4+ تي خلية. يمكن أن يتم هذا التقييم سهولة في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة1،،من23. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الأمراض المعدية، مثل لكمف، درست كلاسيكي CTL وظيفة عن طريق استخدام خلطات كفسي (إستر سوكسينيميديل اسيتات-(and 6) 5-كاربوكسيفلوريسسين) المسماة الخلايا المستهدفة حيث كفسيمرحبا-الخلايا المسماة نابض الببتيد وكفسيلو-المسمى المستهدفة يتم ترك الخلايا أونبولسيد. الخلايا ثم حقنها بنسبة 1:1 وتقييم للخسائر كفسيمرحبا-وصفت الأهداف نابض بالتدفق الخلوي4. واستخدمت نماذج اللقاح ورفض أيضا استراتيجيات مماثلة لتقييم في فيفو قتل بكلا CD8+ وخلايا CD4 خلايا+ T، فضلا عن ناغورني كاراباخ الخلايا5،6. هذا هو مقايسة قوية، ولكن يتطلب استخدام العوامل المعدية رئيس الجهاز المناعي قبل الحقن المستهدف.
هذا البروتوكول، من ناحية أخرى، يتطلب أي عدوى مسبقة من البلد المضيف، ويستخدم بدلاً من ذلك استراتيجية تطعيم رئيس الجهاز المناعي قبل الحقن المستهدف. يتكون هذا التطعيم من وضع المياه على أساس لقاح الببتيد الذي يتطلب توفير immunostimulatory كوكتيل دعا كوبا7، تتألف من مستقبلات مثل عدد القتلى 7 (TLR7) مؤثر (إيميقويمود كريم)، ومكافحة-CD40 ناهضة الأجسام المضادة، و interleukin-2 (إيل-2) مما يؤدي إلى التآزري مزيج من العوامل إيمونوستيمولاتوري للاستثارة فتيلة محددة الببتيد واستجابة مناعية قوية. على هذا النحو، يوفر هذا التحليل قراءات سريعة للدالة CTL كما تدار اللقاح جنبا إلى جنب مع الخلايا لتقييم الدالة إلا ثلاثة أيام قبل حقن الخلايا المستهدفة. وباﻹضافة إلى ذلك، فتيلة كوبا قوية بما يكفي أن قدرة قتل الخلية تي محددة مستضد معبي يمكن أن يرى بين ح 4 و 24 بعد الحقن.
هو تحديد القيد الرئيسي لهذا البروتوكول الجدول الزمني في فيفو للكشف عن القتل المستهدف غير الملائمة إلى antigen والفرضية يجري اختبارها. يجب إجراء تقييم دقيق، كالتغيرات في قوام مستضد، فضلا عن التعديلات الوراثية يجري اختبارها في خلايا تي يمكن أن يؤدي وظيفة CTL التفاضلية التي تتطلب الكشف عن توقيت مختلف للقتل المستهدف. وبالإضافة إلى ذلك، في حين تركيز مناسب من الببتيد للتلقيح قد تم الأمثل لسرطان الجلد البشرية مستضد glycopeptide 100 (hgp10025-33) و ovalbumin257-264 (البويضات257-264)8،9 ، استخدام نموذج مستضد آخر قد يكون أكثر ملاءمة لدراسة معينة تتطلب مزيدا من التحقق من الصحة. بسبب الاختلافات المتوقعة في المستضدات المستهدفة القدرة على حفز CTL المستجيب الدالة في تركيبة مع كوبا وصفها adjuvant، قد يكون الأمثل لايل-2 جرعة التركيز والجرعة التردد ضروري لتحقيق الهدف المنشود. وعموما، هذا البروتوكول يسمح بإجراء تقييم سريع لقتل الدالة في فيفو ويمكن تكييفها مع أي مستضد معين.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن هذا البروتوكول مباشرة، وهناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب أن يتم بعناية. فتيلة كوبا عقب حقن محددة مستضد تي-خلية يجري اختبار ضروري لمعرفة أي قتل الأهداف نابض. وفي حين أنه من الممكن أن التطعيم ضد كوبا المستندة إلى الماء يخلق حالة التهابات حادة، لمرحلة التهاب مزمن، الاستعاضة عن وضع ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل تدعمه أبحاث المعاهد الوطنية للصحة (A1R03AI120027 (RN) و 1R21AI20012 (RN)) ومنح البحوث المؤسسية (RN)، بدء منح (RN)، ومنح البذور MD أندرسون وزارة الجنسية والهجرة (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
Referências
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
