Détection de potentiel de Membrane des mitochondries pour étudier CLIC4 HN4 induite par le Knockdown cellule Apoptosis In Vitro
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’application de la rhodamine 123 pour identifier le potentiel de membrane mitochondrial (MMP) et étudier CLIC4 induite par le knockdown HN4 cellulaire, l’apoptose in vitro. Sous le microscope à fluorescence commun et microscope à fluorescence laser confocale, le changement en temps réel de la MMP a été enregistré.
Abstract
Diminution du potentiel membranaire mitochondrial (MMP, ΔΨm) est considéré comme le premier événement dans la cascade apoptotic. Il arrive même devant les caractéristiques de l’apoptose nucléaire, y compris la condensation de la chromatine et la rupture de l’ADN. Une fois que les effondrements MMP, l’apoptose cellulaire entamera irréversiblement. Une série de colorants cationiques lipophiles peut traverser la membrane de la cellule et agréger à l’intérieur de la matrice de la mitochondrie et servir de marqueur de fluorescence pour évaluer le changement MMP. Comme l’un des six membres de la Cl– famille canal intracellulaire (CLIC), CLIC4 participe dans le processus d’apoptose cellulaire principalement par le biais de la voie mitochondriale. Nous décrivons ici un protocole détaillé permettant de mesurer les MMP via la fluctuation de la fluorescence de la Rhodamine 123 (Rh123), à travers lequel, nous étudions l’apoptose induite par CLIC4 knockdown de surveillance. Nous examinons les avantages et les limites de l’application de confocale à balayage laser et microscope à fluorescence normale en détail et aussi le comparer avec d’autres méthodes.
Introduction
Rh123 est un colorant cationique fluorescence, qui sert d’indicateur pour le potentiel transmembranaire. Rh123 est capable de pénétrer la membrane cellulaire et entrer dans la matrice mitochondriale selon la différence de potentiel à l’intérieur et à l’extérieur de la membrane1. Apoptosis mène aux dommages de l’intégrité de la membrane mitochondriale. Le pore de transition de perméabilité de mitochondrie (MPTP) ouvrira et conduire à l’effondrement de la MMP, qui à son tour entraîne la libération de Rh123 à l’extérieur de la mitochondrie. Enfin, un signal de fluorescence verte sera détecté sous microscope à fluorescence. Il est bien documenté que l’appauvrissement de la MMP et perméabilité membranaire élevée sont des signes précoces de l’apoptose de cellules2. Par conséquent, Rh123 peut être appliqué à la détection des changements MMP et l’apparition de l’apoptose cellulaire.
Comme le 6ème carcinome plus courant dans le monde, cancer de la tête et du cou détériore gravement santé3 une personne. Bien que plusieurs approches ont été développées ces dernières années, les résultats cliniques de traitement pour les patients souffrant de la tête et du cou carcinome épidermoïde (HNSCC) sont toujours pas idéal4. Explorer de nouvelles méthodes thérapeutiques peut améliorer le traitement des HNSCC5. Les canaux ioniques impliquant de nombreux processus biologiques affichent un rôle important dans le développement de différents cancers6. Participation partielle ou totale des canaux Cl– sont fortement impliqués dans diverses propriétés de transformation néoplasique, y compris la migration active, un taux élevé de prolifération et son caractère invasif. Dans ce contexte, le CLIC, une famille de la nouvelle protéine, a été inscrit comme une classe prometteuse de cibles thérapeutiques pour le traitement de cancer6,7. Des études récentes ont révélé que localiser les membres de la famille CLIC dont CLIC5, CLIC1 et CLIC4 à cardiaque mitochondriale et le niveau de l’espèce (ROS) réactives de l’oxygène est augmentée par CLIC5, qui indique le rôle fonctionnel des mitochondries situées Cl – canaux dans l’apoptose réponse8. CLIC4, membres de la famille CLIC (également connu sous le nom mtCLIC, P64H1 et RS43), a été plus particulièrement étudié pour ses propriétés de règlement d’apoptose dans les cellules cancéreuses et l’emplacement sous-cellulaire y compris Golgi, le réticulum endoplasmique et mitochondrie chez l’homme kératinocytes7,9,10. Le profil d’expression de CLIC4 était réglementé par le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), P53 et stimulus externe. Surexpression et downregulation de CLIC4 déclenchent une réponse apoptotique principalement par le biais de la voie mitochondriale accompagnée avec le déséquilibre entre les membres de la famille Bcl-2, activation de la caspase cascade et la libération du cytochrome C11, 12 , 13. par conséquent, mesure de MMP est essentielle afin d’explorer l’apoptose CLIC4 liés et Rh123 sert d’indicateur de fluorescence idéale.
La présente étude décrit un protocole détaillé pour la détection des MMP pour étudier CLIC4 l’apoptose induite par précipitation dans les cellules HN4. Rh123 est utilisé comme une sonde de fluorescence pour observer le changement de la MMP. Sous le microscope à fluorescence commun et microscope à fluorescence laser confocale, la fluctuation en temps réel de la MMP peut être résolue. Nous examinons les avantages et les limites de l’application de confocal laser scanning microscope à fluorescence en détail et aussi le comparer avec d’autres méthodes. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres études liées à l’apoptose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est bien documenté que Cl− canaux est essentielles pour maintenir l’hémostase de l’environnement interne et joue un rôle important dans la prolifération cellulaire et l’apoptose15,16. Comprendre la relation entre l’intervention d’axés sur le canal d’ion et de l’apoptose est donc de grande nécessité et l’importance de trouver une meilleure approche thérapeutique pour divers cancers17. Mitochondries ma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions M. Chao Fang culture cellulaire. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Chine (Grant no 81570403, 81371284) ; Anhui Provincial Natural Science Fondation (subvention no 1408085MH158) ; Remarquable jeune chercheur de l’Université de médecine de Anhui ; Soutenir les programme d’excellents jeunes Talents dans les universités de la Province d’Anhui.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
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