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Bioquímica

Manipulation de molécules simples de G-quadruplexes par pinces magnétiques

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

Une plate-forme de molécules simples pinces magnétiques pour manipuler les G-quadruplexes est signalée, qui permet l’étude de stabilité G4 et règlement de diverses protéines.

Abstract

Structure secondaire de l’acide nucléique non canonique G-quadruplexes (G4) sont impliqués dans divers processus cellulaires, telles que la réplication de l’ADN, transcription, ARN et l’allongement des télomères. Au cours de ces processus, diverses protéines se lient et résoudre les structures G4 pour remplir leur fonction. Comme la fonction G4 dépend souvent de la stabilité de sa structure repliée, il est important d’étudier comment les protéines liant le G4 régulent la stabilité du G4. Ce travail présente une méthode pour manipuler les molécules G4 uniques à l’aide de la pince à épiler magnétique, qui permet des études de la régulation des protéines liant le G4 sur une seule molécule G4 en temps réel. En général, cette méthode consiste à une étendue des applications dans les études des interactions entre protéines/ligands et des règlements sur diverses structures secondaires d’ADN ou d’ARN.

Introduction

Quatre brins ADN ou ARN G4 structures jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques importants1. Beaucoup de protéines est impliquées dans la liaison G4 et de règlement, y compris les protéines de liaison des télomères (télomérase, POT1, TEBPs, RPA, TRF2)1,2, facteurs de transcription (nucléoline, PARP1)3, protéines (hnRNP A1, ARN hnRNP A2)4et réplication de l’ADN hélicases (BLM, FANCJ, RHAU, AVT, Dna2, Pif1)5associés protéines (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. La liaison aux protéines peut stabiliser ou déstabiliser les structures G4 ; ainsi réguler les fonctions biologiques ultérieures. La stabilité du G4 a été mesurée par thermal fusion à l’aide de rayons ultraviolets (UV) ou de méthodes de dichroïsme circulaire (DC)7. Toutefois, ces conditions ne sont pas physiologiques pertinentes et sont difficiles à appliquer à l’étude des effets de liaison des protéines7.

Le développement rapide des technologies de manipulation de la molécule unique a permis à des études de pliage et dépliage d’une biomolécule, tel qu’un ADN ou une protéine, à un niveau de molécule unique avec une résolution nanométrique en temps réel8. Microscopie à force atomique (AFM), pinces optiques et magnétiques pincettes sont les méthodes de manipulation de la molécule unique plus couramment utilisés. Par rapport à l’AFM et pinces optiques9, pincettes magnétiques permettent des mesures stables de pliage-dépliage de la dynamique d’une seule molécule au cours des jours en utilisant une technique de anti-dérive10,11.

Ici, une plate-forme de manipulation de la molécule unique à l’aide de pincettes magnétiques pour étudier la régulation de la stabilité du G4 par des protéines de liaison est signalé12,13. Cet ouvrage décrit les approches de base, y compris les échantillon et flux de préparation de canal, le programme d’installation de pinces magnétiques et la calibration de la force. Le contrôle de la force et les protocoles anti dérive comme décrit dans étape 3 permettent depuis longtemps des mesures de temps sous les divers contrôles de force, comme la force constante (pince de force) et constante de chargement note (force-ramp) et mesure de force-saut. Le protocole d’étalonnage de force décrit à l’étape 4 permet la calibration de la force de < 1µm sangles courtes sur une large force allant jusqu’à 100 pN, avec une erreur relative au sein de 10 %. Un exemple de règlement de la stabilité de l’ARN hélicase associée AU riche en élément (RHAU) hélicase (alias DHX36, G4R1) qui joue un rôle essentiel dans la résolution de que RNA G4 est utilisé pour démontrer les applications de cette plate-forme13.

Protocol

1. préparation de l’ADN G4 pour seule molécule Stretching Prepare 5 '-thiol étiquetés et 5 '-biotine étiqueté dsDNA poignées par PCR à l’aide de polymérase DDNA sur une matrice d’ADN de phage lambda à l’aide de 5 '-thiol et 5 '-biotine amorces 14 ( Figure 1). Les deux poignées de dsDNA ont haute teneur en GC (> 60 %) pour éviter l’ADN fonte lorsque l’ADN est maintenu à des forces ou au cours de l’insuffisance …

Representative Results

Le montage pour étirer une seule molécule G4 est illustré à la Figure 4. Une séquence de formation G4 monocaténaire durée entre deux poignées de dsDNA était attachée entre un lamelle couvre-objet et un talon paramagnétique. Pour trouver une perle captif dsDNA unique, un dosage overstretching a été réalisé en augmentant la force à des taux de charge constante. Trois types de mesures ont été souvent utilisés pour étudier le pliage et le dép…

Discussion

Comme décrit ci-dessus, une plate-forme pour l’étude de la stabilité mécanique de l’ADN du G4 et les interactions de protéine à l’utilisation de G4 seule molécule pincettes magnétiques est signalée. Accompagnant la plate-forme, des protocoles très efficaces de trouver l’attache d’ADN G4 et mesure de la dynamique de pliage-dépliage et la stabilité de la structure de G4 avec résolution spéciale nanomètres sont développés. Le blocage du plan focal permet un contrôle anti-dérive très stable, ce …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Meng Pan pour la relecture du manuscrit. Ce travail est soutenu par Singapour Ministère de l’éducation académique recherche fonds de niveau 3 (MOE2012-T3-1-001) à J.Y. ; la Fondation de recherche National par le biais de la mécanobiologie Institut de Singapour à J.Y. ; la Fondation nationale de la recherche, Office, Singapour du premier ministre, en vertu de son Programme de recherche de NRF (NRF recherche prix no FRO-NRFI2016-03 de J.Y. ; le Fonds de la recherche fondamentale pour les universités de la centrale (2017KFYXJJ153) à H. Y.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
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Referências

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G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics

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Citar este artigo
You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
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