En enkelt-molekyle magnetiske pincet platform til at manipulere G-quadruplexes er rapporteret, som giver mulighed for undersøgelse af G4 stabilitet og regulering af forskellige proteiner.
Ikke-kanoniske nukleinsyre sekundærstruktur G-quadruplexes (G4) er involveret i forskellige cellulære processer, såsom DNA-replikation, transskription, RNA forarbejdning og telomere brudforlængelse. Under disse processer, forskellige proteiner binde og løse G4 strukturer til at udføre deres funktion. Funktionen af G4 ofte afhænger af stabiliteten i sine foldede struktur, er det vigtigt at undersøge, hvordan G4-bindende proteiner regulere stabilitet af G4. Dette arbejde præsenterer en metode til at manipulere enkelt G4 molekyler ved hjælp af magnetiske pincet, som giver studier af reguleringen af G4-bindende proteiner på en enkelt G4 molekyle i realtid. I almindelighed, er denne metode velegnet til et bredt anvendelsesområde applikationer i undersøgelser for proteiner/ligander interaktioner og forordninger om forskellige DNA eller RNA sekundære strukturer.
Fire-strenget DNA eller RNA G4 strukturer spiller en kritisk rolle i mange vigtige biologiske processer1. Mange proteiner er involveret i G4 bindende og regulering, herunder Telomer-bindende proteiner (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transskriptionsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA forarbejdning proteiner (hnRNP A1, hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5og DNA-replikation relaterede proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Protein binding kan stabilisere eller destabilisere G4 strukturer; dermed regulerer de efterfølgende biologiske funktioner. Stabiliteten af G4 blev målt ved termisk smelter ved hjælp af ultraviolet (UV) eller cirkulær dichroism (CD) metoder7. Sådanne forhold er imidlertid ikke fysiologisk relevante og er vanskelige at anvende til at studere virkningerne af bindende proteiner7.
Den hurtige udvikling i enkelt-molekyle manipulation teknologier har aktiveret undersøgelser af folde og udfoldelsen af et biomolekyle, såsom en DNA eller et protein, på en enkelt-molekyle niveau med nanometer opløsning i realtid8. Atomic force mikroskopi (AFM), Optisk pincet og magnetiske pincet er de mest almindeligt anvendte metoder til enkelt-molekyle manipulation. I forhold til AFM og optiske pincet9, tillade magnetiske pincet stabile målinger af folde udfoldning dynamikken i et enkelt molekyle over dage ved hjælp af en anti-drift teknik10,11.
Her, er en enkelt-molekyle manipulation platform ved hjælp af magnetiske pincet til at undersøge regulering af G4 stabilitet af bindende proteiner rapporteret12,13. Dette arbejde skitserer de grundlæggende metoder, herunder prøve og flow-kanal forberedelse, opsætning af magnetiske pincet og kraft kalibrering. Kontrolelementet kraft og protokollerne anti-drift som beskrevet i trin 3 giver mulighed for lang tidsmålinger under forskellige kraft kontrolelementer, som konstant kraft (force klemme) og konstant lastning Vurder (kraft-rampe) og force-jump måling. Kraft kalibrering protokollen beskrevet i trin 4 giver kraft kalibrering af < 1 µm kort bindsler over en bred kraft rækkevidde op til 100 pN, med en relativ fejl inden for 10%. Et eksempel på lovgivning om stabilitet af RNA-Helicase forbundet med AU-rige element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1), spiller væsentlige roller i løsningen af RNA G4 bruges til at demonstrere applikationer på denne platform13.
Som beskrevet ovenfor, en platform for at studere den mekaniske stabilitet af G4 DNA og samspillet mellem protein til G4 ved hjælp af er enkelt-molekyle magnetiske pincet rapporteret. Ledsager platformen, er højeffektive protokoller for at finde G4 DNA tether og måling af folde udfoldning dynamik og stabilitet af G4 struktur med nanometer særlig beslutning udviklet. Brændplanet låsning muliggør yderst stabil anti-drift kontrol, hvilket er vigtigt for påvisning af en lille struktur overgang som G4 (trin størrelse…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Meng Pan til korrekturlæsning af håndskriftet. Dette arbejde er støttet af Singapore Ministeriet for uddannelse akademisk forskning fond Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) til J.Y.; Grundforskningsfond gennem Mechanobiology Institut Singapore til J.Y.; Danmarks Grundforskningsfond, premierministerens kontor, Singapore, under sit NRF Investigatorship program (NRF Investigatorship Award nr. NRF-NRFI2016-03 til J.Y.; den grundlæggende forskningsfonden for Central universiteterne (2017KFYXJJ153) til H. Y.
DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |