JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

Abstract

비 정식 핵 산 보조 구조 G-quadruplexes (G4) DNA 복제, 전사, RNA 가공, 및 telomere 신장 하 여 다양 한 세포질 프로세스에서 포함 된다. 이 프로세스 동안 다양 한 단백질 바인딩 하 고 그들의 기능을 수행 하도록 G4 구조를 해결 합니다. G 4의 함수는 종종 접힌 구조의 안정성에 따라 달라 집니다, 그것은 G4 바인딩 단백질 g 4의 안정성을 조절 하는 방법을 조사 하는 것이 중요. 이 작품 실시간으로 단일 G4 분자에 G4 바인딩 단백질의 레 귤 레이 션의 연구를 가능 하 게 자석 족집게를 사용 하 여 단일 G4 분자를 조작 하는 메서드를 제공 합니다. 일반적으로이 메서드는 상호 작용 단백질/ligands 및 다양 한 DNA 또는 RNA 이차 구조 규정에 대 한 연구에 응용 프로그램의 넓은 범위에 적합 합니다.

Introduction

4 가닥 DNA 또는 RNA G4 구조는 많은 중요 한 생물 학적 과정1에서 중요 한 역할을 재생합니다. 많은 단백질 g 4 바인딩 및 telomere 바인딩 단백질 (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)를 포함 한 규제에 관련 된1,2, 녹음 방송 요인 (nucleolin, PARP1)3, RNA 단백질 (hnRNP A1, 처리 A2 hnRNP)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5, 그리고 DNA 복제 관련 단백질 (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. 단백질 바인딩 수 안정 또는 불안정 G4 구조; 따라서 후속 생물학적 기능을 규제. G 4의 안정성 자외선 (UV) 또는 원형이 색 성 (CD) 방법7을 사용 하 여 용 해 열 측정 했다. 그러나, 이러한 상태는 생리 관련 바인딩 단백질7의 효과 공부 하 고 적용 하기가 어렵습니다.

단일 분자 조작 기술에 급속 한 발전은 폴딩 및 실시간8나노미터 분해능으로 단일 분자 수준에서 단백질, DNA 등 biomolecule의 전개의 연구를 활성화 하 고. 원자 힘 현미경 (AFM), 광학 족집게 및 자석 족집게는 가장 일반적으로 사용 되는 단일 분자 조작 방법. AFM와 광학 핀셋9에 비해, 자석 족집게 반 드리프트 기술을10,11을 사용 하 여 단일 분자의 폴딩 전개 역학의 안정적인 측정을 일 동안 수 있습니다.

여기, 단백질에 바인딩하여 G4 안정성의 규칙을 공부 자석 족집게를 사용 하 여 단일 분자 조작 플랫폼 보고12,13입니다. 이 작품 샘플 및 흐름 채널 준비, 자석 족집게의 설치 힘 보정 등 기본 접근법을 설명 합니다. 힘 제어 및 안티 드리프트 프로토콜에 설명 된 단계 3으로 일정 한 힘 (힘 클램프) 등의 다양 한 포스 컨트롤에서 긴 시간 측정에 대 한 허용 하 고 상수 로드 (포스-램프), 속도 및 힘-점프 측정. 단계 4에서에서 설명한 힘 교정 프로토콜의 힘 보정 가능 < 넓은 힘에 짧은 밧줄 1 µ m 범위 10% 내에서 상대적인 오류와 함께 최대 100 pN. RNA Helicase의 안정성의 규칙의 예를 들어 RNA G413이 플랫폼 응용 프로그램을 설명 하는 해결에 필수적인 역할을 재생 하는 누구나 풍부한 요소 (RHAU) helicase (별칭 DHX36, G4R1)와 관련 된.

Protocol

1. 준비 G4 DNA의 단일 분자 기지개 준비 5 '-thiol 분류 및 5 '-biotin PCR 5를 사용 하 여 람다 파지 DNA 템플렛에 DDNA 중 합 효소를 사용 하 여 dsDNA 핸들 이라고 표시 된 '-thiol 및 5 '-비오 틴 뇌관 14 ( 그림 1). 두 dsDNA 처리는 높은 GC 내용 (> 60%) DNA를 방지 하기 위해 녹는 때 DNA는 높은 힘에서 또는 DNA 잡아당기고 동안 전환 15.</l…

Representative Results

단일 G4 분자 스트레칭을 위한 실험 설정 그림 4에 표시 됩니다. 두 dsDNA 핸들 사이의 스팬 단일 가닥 G4 형성 시퀀스는 coverslip 상자성 구슬 사이 곁에 했다. 단일 dsDNA 테더 비드를 찾으려면 overstretching 분석 결과 일정 로딩 속도로 힘을 증가 하 여 수행 되었다. 세 가지 유형의 측정 접는 공부 하 고 생체의 전개를 위해 자주 사용 했다: (i) 지속적인 힘 측…

Discussion

G4 DNA의 기계적 안정성을 공부 하 고 g 4를 사용 하 여 단백질의 상호 작용을 위한 플랫폼 위에서 설명한 대로 단일 분자 자석 족집게 보고 됩니다. 플랫폼을 동반, G4 DNA 밧줄, 그리고 접는 전개 역학의 측정과 나노미터 특별 한 해상도와 G4 구조의 안정성을 찾는 매우 효율적인 프로토콜 개발 된다. 초점면 잠그기를 통해 g 4 같은 작은 구조 전환이 감지에 대 한 중요 한 매우 안정적인 안티 드리프트 ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 원고를 교정에 대 한 멩 팬을 감사 합니다. 이 작품은 지원에 의해 싱가포르 교육부의 교육 학술 연구 기금 계층 3 (MOE2012-T3-1-001) 재; Mechanobiology 연구소 싱가포르 재;를 통해 연구 재단 국립 연구 재단, 총리의 사무실, 싱가포르, 그것의 NRF Investigatorship 프로그램 (NRF Investigatorship 수상. NRF-NRFI2016-03 재; H. y 중앙 대학 (2017KFYXJJ153)에 대 한 근본적인 연구 기금.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
  2. Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
  3. Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Bioquímica. 49 (45), 9706-9714 (2010).
  4. Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
  5. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  6. Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
  7. Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
  8. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
  9. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  10. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
  11. Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  12. You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
  13. You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
  14. You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
  15. Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
  16. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  17. Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  18. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  19. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  20. Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
  21. Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  22. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  23. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  24. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  25. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  26. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
  27. Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
  28. Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
  29. Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
  30. Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
  31. Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
  32. Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
  33. Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

Tags

Keywords: G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics
check_url/pt/56328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image