JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioquímica

Single-molekylet manipulering av G-quadruplexes av magnetiske pinsett

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

En enkelt-molekylet magnetiske pinsett plattform å manipulere G-quadruplexes er rapportert, gir mulighet for studiet av G4 stabilitet og regulering av ulike proteiner.

Abstract

Ikke-kanoniske nukleinsyre sekundære struktur G-quadruplexes (G4) er involvert i ulike cellulære prosesser, som DNA-replikasjon, transkripsjon, RNA behandling og telomere forlengelse. Under disse prosessene, ulike proteiner binde og løse G4 strukturer for å utføre sin funksjon. Som funksjonen til G4 ofte avhenger stabiliteten i foldet strukturen, er det viktig å undersøke hvordan G4 bindende proteiner regulere stabiliteten på G4. Dette arbeidet gir en metode for å manipulere enkelt G4 molekyler ved hjelp av magnetiske pinsett, som gjør studier av regulering av G4 bindende proteiner på et enkelt G4 molekyl i sanntid. Generelt passer denne metoden for et stort spekter av programmer i studier for proteiner/ligander interaksjoner og forskrift om ulike DNA eller RNA sekundære strukturer.

Introduction

Fire-strandet DNA eller RNA G4 strukturer spille viktige roller i mange viktige biologiske prosesser1. Mange proteiner er involvert i G4 bindende og regulering, inkludert telomere bindende proteiner (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transkripsjonsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA behandling proteiner (hnRNP A1 hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, ADV, Dna2, Pif1)5og utryddelse relaterte proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Protein kan stabilisere eller destabilisere G4 strukturer; Dermed regulerer de påfølgende biologiske funksjonene. Stabiliteten på G4 ble målt ved termisk smelter bruker ultrafiolett (UV) eller sirkulær dichroism (CD) metoder7. Slike forhold er imidlertid ikke fysiologiske relevante og er vanskelig å bruke å studere virkningene av bindende proteiner7.

Den raske utviklingen i enkelt-molekylet manipulasjon teknologi har aktivert studier av folding og utfolder seg i en biomolecule, for eksempel en DNA eller en protein, på en enkelt-molekylet nivå med nanometer oppløsning i sanntid8. Atomic force mikroskopi (AFM) og optiske pinsett magnetiske pinsett er mest brukte single-molekylet manipulasjon metoder. I forhold til AFM og optisk pinsett9, tillater magnetiske pinsett stabil målinger av folding-utspiller seg dynamikken i et eneste molekyl dager ved hjelp av en anti-drift teknikk10,11.

Her er en enkelt-molekylet manipulasjon plattform ved hjelp av magnetiske pinsett for å studere regulering av G4 stabilitet ved å binde proteiner rapporterte12,13. Dette verket beskriver de grunnleggende tilnærmingene, inkludert eksempler og flyt kanal forberedelse, oppsettet av magnetiske pinsett og force kalibreringen. Styrke kontrollen og anti-drift protokollene som beskrevet i trinn 3 tillater lang tid målene under ulike force kontroller som konstant (force klemme) og konstant lasting rate (force-rampen), og styrke-hopp måling. Force kalibrering protokoll beskrevet i trinn 4 kan styrke kalibrering av < 1 µm kort festeseler over en bred styrke rekkevidde opptil 100 pN, med en relativ feil innen 10%. Et eksempel på regulering av stabiliteten av RNA Helicase knyttet til AU-rik element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1) som spiller viktige roller i å løse RNA G4 brukes til å vise programmer denne plattformen13.

Protocol

1. forberedelse av G4 DNA for Single-molekylet strekke forberede 5 '-thiol merket og 5 '-biotin merket dsDNA håndtak av PCR bruke DDNA utvalg på lambda phage DNA mal bruker 5 '-thiol og 5 '-biotin primere 14 ( figur 1). Begge dsDNA håndterer har høy GC innhold (> 60%) for å hindre DNA smelter når DNA holdes på høy styrker eller under DNA overstrekking overgang 15. Renser PCR produkter med en ko…

Representative Results

Eksperimentoppsettet for å strekke et enkelt G4 molekyl er vist i Figur 4. En enkelt-strandet G4 danner sekvens spredt mellom to dsDNA håndtak var bundet mellom en dekkglassvæske og en spinn perle. Du finner en enkelt dsDNA bundet perle ved ble en overstretching analysen utført ved å øke styrken på konstant lasting. Tre typer målinger ble ofte brukt for å studere den folding og utfoldelsen av biomolecules: (i) konstant force måling, (ii) force-rampe…

Discussion

Som beskrevet ovenfor, en plattform for studerer mekanisk stabilitet av G4 DNA og interaksjoner protein G4 bruker rapporteres single-molekylet magnetiske pinsett. Medfølgende plattformen, er høyeffektive protokoller for å finne G4 DNA tether og måling av folding-utspiller seg dynamikken og stabilitet av G4 strukturen med nanometer spesielle oppløsning utviklet. Fokalplanet låsing gjør svært stabile anti-drift kontroll, som er viktig for å oppdage en liten struktur overgang som G4 (trinn størrelse ~ 7 nm) og int…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Meng Pan for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet er støttet av Singapore departementet for utdanning akademisk forskning fondet Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) til J.Y.; National Research Foundation gjennom Mechanobiology Institute Singapore til J.Y.; National Research Foundation, Statsministerens kontor, Singapore, under sitt NRF Investigatorship program (NRF Investigatorship Award nr. NRF-NRFI2016-03 til J.Y.; Grunnforskning fondet for sentral universitetene (2017KFYXJJ153) til H. Y.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
  2. Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
  3. Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Bioquímica. 49 (45), 9706-9714 (2010).
  4. Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
  5. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  6. Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
  7. Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
  8. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
  9. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  10. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
  11. Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  12. You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
  13. You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
  14. You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
  15. Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
  16. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  17. Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  18. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  19. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  20. Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
  21. Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  22. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  23. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  24. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  25. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  26. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
  27. Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
  28. Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
  29. Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
  30. Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
  31. Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
  32. Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
  33. Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

Tags

Keywords: G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics
check_url/pt/56328?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image