شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط
Summary
نحن تقرير الحمض النووي الريبي دبوس صغير (شرنا) والبروتوكول على أساس تسلسل الجيل القادم لتحديد الجهات التنظيمية للمنظمة إكستشروموسومي في خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وتنصهر فيها جينات مقاومة هيجروميسين الميثيل البد ملزمة البروتين 2 ( MeCP2) الجينات على كروموسوم X غير نشط.
Abstract
شاشات الجينية إلى الأمام باستخدام الجينات مراسل إدراجها في هيتيروتشروماتين قد استخدمت على نطاق واسع للتحقيق وآليات الرقابة جينية في نموذج الكائنات الحية. وقد مكنت التكنولوجيات بما في ذلك الكشف دبوس الشعر القصير (شرناس) ومجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) هذه الشاشات في خلايا الثدييات مثنوية. هنا يمكننا وصف شاشة شرنا على نطاق واسع للمنظمين للمنظمة إكستشروموسومي (إكسسي)، باستخدام خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وطرقت جينات مقاومة هيجروميسين في ج-محطة الميثيل البد البروتين الجيني (MeCP2) 2 على إكستشروموسومي غير نشط (الحادي عشر). إعادة تنشيط بناء في خط الخلية مراسل تمنح ميزة البقاء على قيد الحياة تحت هيجروميسين ب التحديد، مما مكننا من شاشة مكتبة كبيرة شرنا وتحديد دبابيس الشعر التي أعادت تنشيط المراسل بقياس التحديد بعد تخصيب اليورانيوم باستخدام تسلسل الجيل القادم. ثم التحقق من دبابيس الشعر المخصب على حدة عن طريق اختبار قدرتها على تنشيط لوسيفراس المراسل في الحادي عشر.
Introduction
أحد الأشكال الأكثر شيوعاً للإعاقة العقلية وراثية في الإناث، ومتلازمة ريت، بسبب الطفرات متخالف في MeCP2، جينات إكستشروموسومي الذي يقوم بترميز بروتين ضروري لوظيفة الخلايا العصبية الطبيعية1. اتباع نهج محتمل لعلاج هذا الاضطراب سيكون تنشيط اليل MeCP2 البرية من نوع الحادي عشر، كما تبين ذلك استعادة التعبير MeCP2 لعكس العجز العصبية في نموذج الفأر من هذا المرض1، 2 , 4-بيد إسكات جينية من واحد من اثنين من الكروموزومات في خلايا الإناث العاشر هو الإبقاء على أحكام طوال العمر الافتراضي لكائن حي3،4، والمرجح أن تتطلب تنشيط قوية من الجينات الحادي عشر رئيسية اضطراب في مسارات تنظيمية جينية متعددة.
تحديد العوامل اللازمة للصيانة لإسكات MeCP2 ، وضعنا أول نموذج ماوس المحورة وراثيا تحمل MeCP2-لوسيفراس-هيجروميسين مقاومة جينات انصهار (MeCP2-لوك-الموارد البشرية) على واحد من اثنين من الكروموزومات العاشر (س MeCP2-LUC-HRسMeCP2)5. على الرغم من أن MeCP2 أعرب عن بناء الانصهار أثبتت أنها غير مستقرة، وأسفرت عن فقدان وظيفة، محاكاة phenotypically MeCP2 الحذف في الذكور هيميزيجوس (X/YMeCP2-لوك-الموارد البشرية)، والتعبير عن الجينات مراسل كان من الممكن اكتشاف سهولة في نمط متسق مع التعبير عن الذاتية MeCP25. نحن ثم ولدت الحيوانات المستنسخة مخلدة تنتجها الخلايا الليفية مع البناء على إكستشروموسومي نشطة أو غير نشطة، وأكدت أن السابق أعرب عن نوع البرية MeCP2 ولا في بناء مراسل؛ معكوس كان صحيحاً لهذا الأخير. عندما تتعرض للحمض النووي ديميثيلاتينج عامل معروف أن تلغي إسكات الجينات، 5-أزاسيتيديني (5-عزة)، الخلايا مع المراسل في الحادي عشر (“خلايا مراسل”) اكتسب النشاط في مقايسة الإضاءة الحيوية، مشيراً إلى أن لدينا بناء يمكن أن يعاد تنشيط وبالتالي وتستخدم للفحص الوراثي.
لقد طورنا التالية شاشة وراثية الفائق للمنظمين لإسكات MeCP2 . خط الخلية مراسل أول مصاب بالفيروس المكتبة التي تحتوي على > 60,000 شرناس مختلفة تستهدف > الجينات 25,000 طوال5،الماوس الجينوم6، وبعد ذلك تعرض لاختيار هيجروميسين ب. مقارنة تواتر دبوس في مرحلة ما قبل وما بعد اختيار العينات باستخدام تسلسل الجيل القادم، كمراسل تنشيط تمنح ميزة النمو ضمن التحديد هيجروميسين ب وأدت إلى إثراء المسؤولين دبابيس الشعر. باستخدام هذا النهج، حددنا 30 الجينات المتورطين في MeCP2 إسكات، وأكدت في وقت لاحق النتائج ترانسدوسينج الخلايا مراسل مع دبابيس الشعر الفردية وقياس نشاطها لوسيفراس.
Protocol
Representative Results
Discussion
في مؤخرا دراسة6ونحن إنشاء خط خلية مورين مع لوسيفراس وجينات مقاومة هيجروميسين تنصهر فيها MeCP2 في الحادي عشر، وترانسدوسيد أنه مع مكتبة > استهداف شرناس 60,000 > 25,000 الجينات. وجدنا 30 الجينات التي ميزة تدق لأسفل الممنوحة للبقاء على قيد الحياة تحت هيجروميسين ب التحديد، مما يوحي بدو?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ديكينس روس من جامعة ملبورن تكرم توفير مكتبة شرنا المستخدمة في الشاشة. تم تمويل هذا العمل من ريت متلازمة البحوث الثقة (أتال بيهاري).
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
Referências
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2′-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
