Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran
Summary
Biz bir küçük saç tokası RNA (shRNA) ve düzenleyiciler, x kromozomu inactivation ateş böceği luciferase ile bir fare hücre satırı tanımlamak için sonraki nesil sıralama tabanlı iletişim kuralı raporu ve hygromycin direnç genleri metil için erimiş CpG bağlayıcı protein 2) MeCP2) etkin olmayan X kromozomu üzerindeki gen.
Abstract
Heterochromatin eklenen reporter genler kullanarak ileri genetik ekranlar kapsamlı model organizmalar epigenetik kontrol mekanizmaları araştırmak için kullanılmaktadır. Kısa saç tokası RNA’ların (shRNAs) ve kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) gibi teknolojiler böyle ekranlar diploit memeli hücrelerinde etkinleştirdiniz. Burada bir fare hücre satırı ile ateş böceği luciferase kullanarak x kromozomu inactivation (XCI), düzenleyiciler için bir büyük ölçekli shRNA ekran açıklamak ve hygromycin direnç genleri içinde metil CpG bağlayıcı protein C-terminus adlı 2 (MeCP2) gen çaldı etkin olmayan x kromozomu üzerinde (XI). Muhabiri hücre kültürünü inşa reaktivasyonu sağkalım avantajı hygromycin B seçimi, büyük shRNA kitaplık ekranı ve onların sonrası seçim zenginleştirme kullanarak ölçerek muhabir yeniden saç tokaları tanımlamak olanaklı kılar altında doğan yeni nesil sıralama. Zenginleştirilmiş saç tokaları sonra tek tek XI luciferase kahramanlarına etkinleştirmek için yeteneklerini sınayarak geçerliliği.
Introduction
Bir kadın, Rett sendromu, kalıtsal akıl bozukluğu en yaygın formları be neden yanında MeCP2, normal nöronal fonksiyon1için önemli bir protein kodlar bir x kromozomu gen heterozigoz mutasyonlar. Bu hastalık1, , bir fare modeli nörolojik açıkları tersine çevirmek için restorasyon MeCP2 ifadesinin gösterildiği bu hastalığın tedavisi için potansiyel bir yaklaşım vahşi tipi MeCP2 alleli Xi üzerinde reaktivasyonu olacaktır 2 , 4. ancak, bir iki X kromozomları dişi hücrelerdeki epigenetik susturmak sıkı bir organizma3,4ömrü muhafaza ve sağlam bir Xi gen reaktivasyonu büyük olasılıkla büyük bir gerektirir birden çok epigenetik yasal yolları bozulma.
Biz faktörler MeCP2 damping bakım için gerekli belirlemek için önce MeCP2– luciferase – hygromycin direnç gen füzyon (MeCP2-LUC-HR) birinde iki X kromozomu taşıyan bir transgenik fare modeli geliştirildi (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Her ne kadar füzyon yapı ifade MeCP2 kararsız ve işlevi, phenotypically taklit eden MeCP2 silme (XMeCP2-LUC-HR/y) hemizygous erkeklerde, muhabir gen ifade kaybına neden olduğu ortaya çıktı kolayca algılanabilir bir desen endojen MeCP25ifadesi ile tutarlı oldu. Daha sonra ölümsüzleştirdi fibroblast klonlar etkin olmayan veya active x kromozomu üzerinde yapı ile oluşturulan ve o eski vahşi türü MeCP2 ve değil muhabiri yapı ifade doğruladı; tersini ikincisi için doğruydu. Gen susturmak, iptal etmek için bilinen Ajan demethylating bir DNA için 5-azacytidine (5-AZA), maruz kaldığında Xi (“muhabiri hücre”) muhabiri hücre bizim yapı yeniden gösteren bir bioluminescence tahlil etkinliği kazandı ve bu nedenle genetik tarama için kullanılan.
Biz sonraki yüksek üretilen iş genetik bir ekran MeCP2 damping düzenleyiciler için geliştirilmiştir. Muhabiri hücre kültürünü ilk içeren bir retroviral kütüphane ile enfekte > 60.000 farklı shRNAs hedefleme > fare genom5,6, boyunca 25.000 genler ve sonra hygromycin B seçime tabi. Saç tokası frekans içinde ön karşılaştırıldı ve sonraki nesil sıralama kullanarak sonrası seçim örnekleri, muhabir olarak yeniden etkinleştirme büyüme avantajı hygromycin B seçimi altında doğan ve sorumlu saç tokaları zenginleştirme sonuçlandı. Bu yaklaşımı kullanarak, biz 30 genler susturmak MeCP2 içinde karıştığı tespit ve sonra bulgular muhabiri hücre bireysel saç tokaları ile transducing ve luciferase faaliyetlerini ölçme doğruladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim son6çalışma, biz bir fare hücre kültürünü luciferase ile oluşturulan ve hygromycin direnç genleri MeCP2 Xi üzerinde erimiş ve bir kütüphane ile transduced > shRNAs 60.000 hedefleme > 25.000 gen. 30 genler olan knock-down haiz sağkalım avantajı hygromycin B seçimi altında MeCP2 ve x kromozomu susturmak kontrol içindeki rollerine düşündüren bulduk. Bu sonuçlar bireysel saç tokaları ile bildirilen hücre kültürünü transducing ve sessiz luciferase…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ross Dickins Melbourne Üniversitesi nezaketle belgili tanımlık perde içinde kullanılan shRNA Kütüphane sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser Rett Sendromu araştırma güven (A.B. tarafından) finanse edildi.
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
Referências
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2′-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
