Poolet shRNA skærmen for reaktivering af MeCP2 på det inaktive X kromosom
Summary
Vi rapporterer en lille hårnål RNA (shRNA) og næste generation sequencing-baseret protokol til at identificere regulatorer af x-kromosom Inaktiveringen i en murine cellelinie med firefly luciferase og hygromycin resistensgener smeltet til methyl CpG bindende protein 2) MeCP2) gen på det inaktive X kromosom.
Abstract
Fremad genetiske skærme bruger reporter gener indsættes i heterochromatin har været flittigt brugt til at undersøge epigenetiske kontrolmekanismer i modelorganismer. Teknologier, herunder kort hårnål RNA’er (shRNAs) og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) har aktiveret sådanne skærme i diploide pattedyrsceller. Beskriver her vi en storstilet shRNA skærm til regulatorer af x-kromosom Inaktiveringen (XCI), ved hjælp af en murine cellelinie med firefly luciferase og hygromycin resistensgener bankede i C-endepunktet for methyl CpG bindende protein 2 (MeCP2) genet på det inaktive x-kromosom (Xi). Reaktivering af construct i reporter cellelinie tillægges overlevelsesfordel under hygromycin B valg, gør det muligt for os at screene store shRNA bibliotek og identificere Hårnåle, genaktiveret reporter ved at måle deres post udvalg berigelse ved hjælp af næste generation sequencing. De beriget Hårnåle blev derefter individuelt valideret ved at teste deres evne til at aktivere luciferase reporter på Xi.
Introduction
En de mest almindelige former for arvelige mental svækkelse i hunner, Rett syndrom, er forårsaget af heterozygous mutationer i MeCP2, et x-kromosom-gen, der koder et protein, der er nødvendige for normal neuronal funktion1. En potentiel tilgang til behandling af denne lidelse skulle reaktivering af den MeCP2 vildtypeallelen på Xi, som restaurering af MeCP2 udtryk var vist sig at vende neurologiske underskud i en musemodel af denne sygdom1, 2 , 4. men epigenetiske hæmning af en af de to X-kromosomer i celler, kvindelige stramt vedligeholdes i hele levetiden for en organisme3,4, og robust reaktivering af en Xi gen vil sandsynligvis kræve en større forstyrrelser i flere epigenetisk regulering veje.
For at identificere faktorer, der er nødvendige for opretholdelsen af MeCP2 hæmning, vi først udviklet en transgene musemodel bærer en MeCP2– luciferase – hygromycin resistens gen fusion (MeCP2-LUC-HR) på en af de to X-kromosomer (X MeCP2-LUC-HRxMeCP2)5. Selv om MeCP2 udtrykt fra fusion konstruere viste sig for at være ustabil og resulterede i et tab af funktion, fænotype efterligner MeCP2 sletning i hemizygous hanner (XMeCP2-LUC-HR/Y), udtryk for reporter gener var let påviselige i et mønster, der er konsistent med udtrykket af endogene MeCP25. Vi derefter genereret udødeliggjort fibroblast kloner med konstruktion på enten inaktiv eller aktiv x-kromosom, og bekræftede, at tidligere udtrykt vildtype MeCP2 og ikke journalist konstruere; omvendt var tilfældet for sidstnævnte. Når de udsættes for et DNA demethylating agent kendt at ophæve genhæmning, 5-azacytidine (5-AZA), celler med reporter på Xi (“reporter celler”) fik aktivitet i en bioluminescens assay, der angiver, at vores konstruere kunne genaktiveres og derfor anvendes til genetisk screening.
Dernæst udviklede vi en høj overførselshastighed genetiske skærm til regulatorer af MeCP2 hæmning. Reporter cellelinie var først inficeret med en retroviral bibliotek indeholdende > 60.000 forskellige shRNAs målretning > 25.000 gener hele musen genom5,6og derefter udsat for hygromycin B udvalg. Hårnål frekvens blev sammenlignet i før og efter udvalg prøver ved hjælp af næste generation sequencing, som reporter reaktivering vækst fordel under hygromycin B udvælgelse og resulterede i berigelse af ansvarlig Hårnåle. Brug denne fremgangsmåde, vi identificeret 30 gener involveret i MeCP2 hæmning, og senere bekræftet af resultaterne af transducing reporter celler med individuelle Hårnåle og måle deres luciferase aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vores seneste undersøgelse6, vi genereret en murine cellelinie med luciferase og hygromycin resistensgener sammenvokset til MeCP2 på Xi, og transduced det med et bibliotek med > 60.000 shRNAs målretning > 25.000 gener. Vi fandt 30 gener hvis knock-down konfererede overlevelsesfordel under valg af hygromycin B tyder på deres rolle i kontrol af MeCP2 og x-kromosom hæmning. Disse resultater er blevet godkendt af transducing den rapporterede cellelinie med individuelle Hårnå…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ross Dickins af University of Melbourne allernådigst giver shRNA biblioteket anvendes i skærmen. Dette arbejde blev finansieret af Rett syndrom forskning Trust (A.B.).
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
Referências
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2′-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
