ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo
Summary
Divulgamos una pequeña horquilla RNA (shRNA) y el siguiente protocolo basado en la secuencia de generación para la identificación de reguladores de la inactivación del cromosoma x en una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina fusionado a la metil CpG Unión proteína 2 ( MeCP2) gen en el cromosoma X inactivo.
Abstract
Avance genéticos pantallas usando genes del reportero insertados en la heterocromatina se han utilizado para investigar los mecanismos de control epigenético en organismos modelo. Tecnologías incluyendo horquilla corta RNAs (shRNAs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) han permitido que tales pantallas en células de mamíferos diploides. Aquí describimos una pantalla shRNA a gran escala de los reguladores de la inactivación del X-cromosoma (XCI), utilizando una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina golpeó en el c-término de la proteína de unión a CpG de metilo 2 (MeCP2) gene en el cromosoma x inactivo (Xi). Reactivación de la construcción en la línea celular de reportero confiere ventaja de supervivencia en selección de higromicina B, lo que nos permite una biblioteca grande de shRNA y identificar reguladores que reactivaron el reportero midiendo su selección posterior enriquecimiento utilizando secuenciación de próxima generación. Las horquillas enriquecidas entonces fueron validadas individualmente por prueba de su capacidad para activar el reportero de luciferasa en Xi.
Introduction
Una las formas más comunes de deficiencia mental hereditaria en las mujeres, el síndrome de Rett, es causada por mutaciones heterozigóticas en MeCP2, un gen del cromosoma x que codifica una proteína esencial para la función neuronal normal1. Un enfoque potencial para el tratamiento de este trastorno sería la reactivación del alelo tipo salvaje de MeCP2 en la Xi, como restauración de expresión MeCP2 fue demostrado revertir déficits neurológicos en un modelo de ratón de esta enfermedad1, 2 , 4. sin embargo, silenciamiento epigenético de uno de los dos cromosomas en las células femeninas de X se mantiene bien durante toda la vida de un organismo3,4, y sólida reactivación de un gen Xi probablemente requeriría una mayor interrupción en múltiples vías de regulación epigenéticas.
Para identificar los factores necesarios para el mantenimiento del silenciamiento de MeCP2 , primero desarrollamos un modelo de ratón transgénico con una fusión de genes de resistencia MeCP2– luciferasa – Higromicina (MeCP2-LUC-HR) en uno de los dos cromosomas X (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Aunque el MeCP2 expresada desde la construcción de la fusión demostró para ser inestable y dio lugar a una pérdida de función, fenotípicamente mímico eliminación de MeCP2 en varones hemizygous (X /YMeCP2-LUC-HR), la expresión de los genes del reportero era fácilmente perceptible en un patrón consistente con la expresión endógena de MeCP25. A continuación genera clones del fibroblasto inmortalizado con el constructo en el cromosoma x inactivo o activo y confirmó que el ex expresó tipo MeCP2 y no la construcción de reportero; el inverso era verdad para estos últimos. Cuando se expone a un ADN desmetilantes agente conocido derogar silenciamiento génico, 5-azacitidina (5-AZA), las células con el reportero de la Xi (“células de reportero”) ganaron la actividad en un ensayo de bioluminiscencia, que indica que la construcción podría ser reactivado y por lo tanto utilizado para la investigación genética.
A continuación desarrollamos una pantalla genética de alto rendimiento para los reguladores del silenciamiento de MeCP2 . La línea celular de reportero primero fue infectada con una biblioteca retroviral que contiene > 60.000 diferentes shRNAs dirigidos a > 25.000 genes en el genoma de ratón5,6y después sometida a higromicina B selección. Se comparó la frecuencia de horquilla en pre- y post selección muestras utilizando la siguiente secuencia de generación, como reportero de reactivación confiere ventaja del crecimiento en la selección de higromicina B y dio lugar a enriquecimiento de horquillas responsables. Usando este acercamiento, identificado 30 genes implicados en MeCP2 silenciamiento y posteriormente confirmó los resultados de medir su actividad de luciferasa y transducción de las células de reportero con reguladores individuales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En nuestro estudio reciente6, hemos generado una línea celular murina con luciferasa y genes de resistencia a Higromicina fusionado a MeCP2 en el Xi y transduced con una biblioteca de > 60.000 shRNAs dirigidos a > 25.000 genes. Se encontraron 30 genes cuya ventaja en la supervivencia conferida precipitación en higromicina B selección, sugiriendo su papel en el control de MeCP2 y silenciamiento del cromosoma x. Estos resultados fueron validados por transducción de la línea ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ross Dickins de la Universidad de Melbourne para proporcionar amablemente la biblioteca shRNA utilizada en la pantalla. Este trabajo fue financiado por Rett síndrome Research Trust (A.B.).
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
Referências
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