Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+
Summary
Uma população altamente pura de megacariócitos pode ser Obtida de cordão hemoderivados CD34+ células. Um método para CD34+ diferenciação de isolamento e megacariócito célula está descrita aqui.
Abstract
A produção de plaquetas ocorre principalmente na medula óssea em um processo conhecido como thrombopoiesis. Durante thrombopoiesis, células progenitoras hematopoiéticas diferenciam de precursores de plaquetas de formulário chamados megacariócitos, que diferenciam terminal para liberar as plaquetas de processos citoplasmáticos tempo denominados proplatelets. Megacariócitos são células raras confinadas à medula óssea e, portanto, são difíceis de colheita em número suficiente para uso em laboratório. Produção eficiente de megacariócitos humanas pode ser alcançada em vitro por cultivo CD34+ células sob condições apropriadas. O protocolo detalhado aqui descreve o isolamento de CD34+ células por célula magnética, classificação de amostras de sangue de cordão umbilical. São descritos os passos necessários para produzir megacariócitos altamente puros, maduros, em condições de livre de soro. Detalhes de análise fenotípica de diferenciação megacariócito e determinação da produção proplatelet de formação e plaquetas também são fornecidos. Efetores que influenciam a diferenciação do megacariócito e/ou formação proplatelet, tais como anticorpos anti-plaquetários ou mimetics trombopoietina, podem ser adicionados às células cultivadas para examinar a função biológica.
Introduction
Isolamento de números adequados de megacariócitos humanos primários (MK) para uso em laboratório regular não é viável devido a sua baixa frequência na medula óssea, onde eles representam ~0.01% de células nucleadas1. Uma alternativa conveniente é a expansão ex vivo e diferenciação de tronco hematopoiético e células progenitoras na presença de fatores de crescimento específicos. Um número de citocinas, incluindo o fator de células-tronco (SCF; c-kit ligand) e interleucina (IL) -3 e IL-11 foram empregadas nos sistemas de cultura para produzir MKs. Thrombopoietin (TPO) é o fator mais eficaz de crescimento e diferenciação para culturas megakaryocytic e é eficaz, sozinho ou com outras citocinas, tais como SCF e IL-32. TPO pode agir sobre as populações de células-tronco para ocasionar a proliferação e a maturação dos MKs2.
E MK produzem plaquetas de protrusões citoplasmáticas, chamados proplatelets, in vivo, aproximadamente 1 x 1011 plaquetas formada diariamente para manter a contagem de plaquetas de 150-400 x 109plaquetas /L. produção em vitro é até 1000 -Dobre inferior a na vivo estima3, e isto tem dado origem a inúmeras condições de cultura usando CD34+ células progenitoras hematopoiéticas para melhorar MK e plaquetas produção em vitro. A fonte inicial de CD34+ células utilizadas para diferenciação de MK foi sangue periférico humano4. Outras fontes de célula incluem a medula óssea5,6, células-tronco embrionárias/induzida (ESC/iPSC) as células-tronco pluripotentes7e cordão umbilical sangue (UCB)8,9,10 . Medula óssea humana CD34+ 11 e mouse linhagem negativa da medula óssea células5 produtos MK e plaquetas in vitro; no entanto, a falta de disponibilidade de medula óssea humana limita a sua utilização como fonte de CD34+ células. Em contraste, ESC e iPSC representam uma fonte ilimitada de células para a produção de plaquetas em vitro . Produção de plaquetas a partir dessas células requer alimentador células como murino células OP9 e períodos mais longos de cultura. As plaquetas derivadas no alimentador-free condições parecem ser menos funcional12. iPSC-derivado de plaquetas são susceptíveis de ser de uso em ambientes clínicos desde que eles podem ser expandidos para grande escala. Este processo requer transdução mediada por Lentivirus de fatores de transcrição e de cultura de células a longo prazo13.
UCB é uma fonte acessível de CD34+ células que podem ser facilmente usadas em configurações de pesquisa. TPO sozinho pode promover a diferenciação da medula hemoderivados CD34+ células e isto dá origem a MKs altamente puro, maduro, sem a necessidade de suplementação de soro ou co-cultura com células do alimentador. Outras citocinas tais como SCF pode diminuir a diferenciação da UCB CD34+ células, enquanto o ligante Flt-3 e IL-11 promovem a produção de megacariócitos imaturo14. Este protocolo descreve a produção de culturas de MK altamente puras do sangue do cordão CD34+ células em condições de livre de soro.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui é adequado para uma produção consistente de MK e plaquetas na cultura do sangue do cordão umbilical. Estas células podem ser usadas para estudar vários processos tais como o efeito de drogas ou atividades biológicas na MK proliferação, diferenciação, proplatelet de formação e produção de plaquetas.
Uma variedade de meios de cultura e combinações de citocinas foram apresentados na literatura. Adição de citocinas, como fator de células-tronco, ligant…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio da saúde australiano e Medical Research Council (projeto concessão 1012409 ligado ao BHC).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
Referências
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