Мегакариоцитов дифференциации и образование тромбоцитов от человека пуповинной крови производные CD34 клетки+
Summary
Очень чисто населения megakaryocytes могут быть получены из пуповинной крови производные CD34+ клеток. Метод для CD34+ изоляции и мегакариоцитов дифференцировки клеток описана здесь.
Abstract
Производство тромбоцитов происходит главным образом в костном мозге в процессе, известном как thrombopoiesis. Во время thrombopoiesis прародитель гемопоэтических клеток дифференцировать в форме прекурсоров тромбоцитов под названием megakaryocytes, которые неизлечимо дифференцировать выпустить тромбоцитов долго цитоплазматических процессов, называемых proplatelets. Megakaryocytes являются редкие клетки, ограничивается костного мозга и поэтому трудно урожай в достаточном количестве для лабораторного использования. Эффективное производство человеческого megakaryocytes может быть достигнуто в пробирке путем культивирования CD34+ клеток при подходящих условиях. Протокол, здесь подробно описывает изоляции CD34+ клеток, магнитные ячейку Сортировка от образцов пуповинной крови. Описаны необходимые шаги для получения чистой, зрелый megakaryocytes сыворотки свободных условиях. Предоставляются также детали фенотипического анализа мегакариоцитов дифференциации и определение производства proplatelet формирования и тромбоцитов. Эффекторы, влияющих мегакариоцитов дифференциации и/или proplatelet формирования, такие как антитела анти-тромбоцитарный или thrombopoietin mimetics, могут быть добавлены культивируемых клеток, чтобы изучить биологические функции.
Introduction
Изоляция адекватного числа первичных человеческих megakaryocytes (MK) для использования регулярных лабораторных невозможно из-за их низкой частоты в костном мозге, где они составляют ~0.01% ядерных клеток1. Удобной альтернативой является расширение ex vivo и дифференциации кроветворных стволовых и прогениторных клеток при наличии определенных факторов роста. Количество цитокинов, включая фактор стволовых клеток (СКФ; c комплект лигандом) и интерлейкина (IL) -3 и Ил-11 были заняты в системах культуры производить МКС. Thrombopoietin (ТПО) является наиболее эффективным фактором роста и дифференцировки для мегакариоцитарная культур и является эффективным в одиночку или с другими цитокинов, таких как СКФ и Ил-3-2. ТПО может действовать на население стволовых клеток в результате распространения и созревания МКС2.
MK производят тромбоцитов от цитоплазмы выступов, называется proplatelets и, в-vivo, примерно 1 х 1011 тромбоцитов формируется ежедневно для поддержания количества тромбоцитов в 150-400 x 109выпускаться тромбоцитов производства в пробирке — до 1000 -раз ниже, чем в естественных условиях оценки3, и это породило многочисленные культуры условий с помощью CD34+ клетки гемопоэтических предшественников для улучшения МК и тромбоцитов производства в пробирке. Первоначальный источник CD34+ ячеек, используемых для дифференциации MK было4периферической крови человека. Другие мобильные источники включают в себя костный мозг5,6, эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ESC/iPSC)7и пуповинной крови (УКБ)8,9,10 . Костного мозга человека CD34+ 11 и мыши линии отрицательных костного клетки5 продукции МК и тромбоцитов в vitro; Тем не менее, отсутствие наличия костного мозга человека ограничивает его использование в качестве источника CD34+ клеток. В противоположность этому ESC и iPSC представляют неограниченный источник клеток для производства в vitro тромбоцитов. Тромбоцитов производство из этих клеток требует фидер клеток, таких как мышиных OP9 клеток и дольше культуры. Тромбоцитов, полученных в условиях свободной подачи, как представляется, менее функциональной,12. iPSC производные тромбоцитов, вероятно быть применения в клинических условиях, так как они может быть расширена в крупном масштабе. Этот процесс требует лентивирусные опосредованной трансдукции факторов транскрипции и долгосрочные культуры клеток13.
UCB является доступным источником CD34+ клетки, которые могут быть легко использованы в исследования параметров. ТПО только может способствовать дифференциации шнура крови производные CD34+ клеток и это приводит к очень чистый, Зрелые МКС без необходимости в сыворотке добавок или совместного культуры с клетки фидера. Другие цитокины такие как СКФ может уменьшить дифференциации от UCB CD34+ клеток, в то время как лиганд Flt-3 и Ил-11 содействовать производству незрелых megakaryocytes14. Этот протокол описывает производства высоко чистых культур МК из пуповинной крови CD34+ клеток в условиях свободной от сыворотки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь подходит для последовательного производства МК и тромбоцитов в культуре из пуповинной крови. Эти клетки могут использоваться для изучения различных процессов, таких как воздействие наркотиков или биологической деятельности на МК распространения, дифференц?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают поддержке здравоохранения Австралии и Совет медицинских исследований (проект Грант 1012409 связан с БХК).
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
Referências
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -. J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
