Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri
Summary
Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.
Abstract
Trombosit üretim başta olmak üzere thrombopoiesis bilinen bir işlem kemik iliğinde görülür. Thrombopoiesis sırasında hematopoetik progenitör hücre ölümcül trombosit proplatelets olarak adlandırılan uzun sitoplazmik işlemlerden serbest bırakmak için ayırt megakaryocytes denilen formu trombosit öncüleri ayırt etmek. Megakaryocytes nadir hücreler kemik iliği sınırlı ve bu nedenle labaratuar kullanımı için yeterli sayıda hasat etmek zordur. Verimli üretim insan megakaryocytes, CD34 kültür tarafından elde vitro olabilir+ hücreleri uygun koşullar altında. Burada ayrıntılı protokolünü CD34 yalıtım açıklar+ hücreleri göbek kordonu kan örnekleri sıralama manyetik hücre. Serum-Alerjik koşullar altında son derece saf, olgun megakaryocytes üretmek için gerekli adımları açıklanır. Fenotipik analiz megakaryocyte farklılaşma ve proplatelet oluşumu ve trombosit üretim belirlenmesi ayrıntılarını da temin edilmektedir. Megakaryocyte farklılaşma ve/veya anti-trombosit antikorlar veya thrombopoietin mimetics gibi proplatelet oluşumu etkilemek effectors kültürlü hücrelere biyolojik işlevi incelemek için eklenebilir.
Introduction
Yalıtım birincil insan megakaryocytes (MK) düzenli labaratuar kullanımı için yeterli sayıda burada çekirdekli hücreler1~0.01% için hesap onların düşük frekanslı kemik iliğinde nedeniyle mümkün değildir. Ex vivo genişleme ve hematopoetik kök ve belirli büyüme faktörleri varlığında progenitör hücre farklılaşması bir uygun alternatiftir. Sitokinler kök hücre faktörü (SCF; c-kit ligand) ve İnterlökin (Il) -3 ve IL-11 de dahil olmak üzere bir dizi olmuştur MKs. Thrombopoietin (TPO) üretmek için kültür sistemlerinde istihdam megakaryocytic kültürler için en etkili büyüme ve farklılaşma faktörü olduğunu ve tek başına veya diğer sitokinler, SCF ve IL-32gibi ile etkilidir. TPO kök hücre popülasyonlarının yayılması ve MKs2olgunlaşma neden üzerinde hareket edebilir.
MK üretmek trombosit proplatelets adı verilen sitoplazmik çıkıntılar üzerinden ve, içinde vivo, yaklaşık 1 x 1011 trombosit günlük trombosit sayısı 150-400 x 109/l trombosit üretim vitro sürdürmek için kurulan 1000 kadar olmasıdır -kat vivo içinde 3tahmin ediyor ve bu artış CD34 kullanarak çok sayıda kültür koşulları vermiştir daha düşük+ MK ve trombosit üretim vitrogeliştirmek için hematopoetik progenitör hücre. CD34 ilk kaynak+ MK farklılaşma için kullanılan hücre insan periferik kan4oldu. Diğer hücre kaynakları kemik iliği5,6, embriyonik kök hücre/indüklenen pluripotent kök hücreler (ESC/IPSC)7ve göbek kordon kanı (UCB)8,9,10 yer alıyor . İnsan kemik iliği CD34+ 11 ve fare lineage negatif kemik iliği hücreleri5 üretmek MK ve trombosit içinde vitro; Yine de, insan kemik iliği kullanılabilirlik eksikliği CD34 kaynağı olarak kullanılmasını sınırlar+ hücreleri. Buna ek olarak, ESC ve IPSC hücre vitro trombosit üretim için sınırsız bir kaynağı temsil eder. Trombosit üretim bu hücrelerden besleyici hücreler fare OP9 hücreleri ve daha uzun kültür süre gibi gerektirir. Trombosit koşullarda besleyici-Alerjik türetilmiş daha az işlevsel12görünmektedir. trombosit IPSC kaynaklı ondan beri onlar-ebilmek var olmak genişlemek için büyük ölçüde klinik ortamlarında kullanımı olması muhtemel. Bu işlem lentiviral-aracılı iletim transkripsiyon faktörleri ve uzun vadeli hücre kültür13gerektirir.
UCB CD34 erişilebilir bir kaynak olduğunu+ kolayca kullanılabilir hücre araştırma ayarları. TPO yalnız kordon farklılaşma teşvik kan kaynaklı CD34+ hücreleri ve bu son derece saf, olgun MKs ezelî belgili tanımlık lüzum için serum takviyesi ya da besleyici hücreler ile ortak kültür için artış verir. Diğer sitokinler SCF farklılaşma UCB CD34 dan düşebilir gibi Flt-3 ligand ve IL-11 olgunlaşmamış megakaryocytes14üretimini teşvik ederken+ , hücreleri. Bu protokolünü açıklar yüksek saf MK kültürler kordon kanı CD34+ üretim koşullarında serum içermeyen hücreler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol MK ve trombosit kültür göbek kordon kanı üzerinden tutarlı üretimi için uygundur. Bu hücreler MK yayılması, farklılaşma, proplatelet oluşumu ve trombosit üretim uyuşturucu veya biyolojik etkinlikler etkisi gibi çeşitli işlemler çalışma için kullanılabilir.
Çeşitli kültür medya ve sitokin kombinasyonları literatürde mevcuttur. Toplama+ kök hücre faktörü, Flt-3 ligand, IL-3 ve Il-6 destekler CD34 gibi sitokinler, hücre ço…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Avustralya sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (grant 1012409 BHC için bağlı proje) desteğiyle kabul etmiş oluyorsunuz.
Materials
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
Referências
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -. J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
