أسلوب أنبوب الاسطوانة المعدلة لتصوير متقطعة الذات المترجمة ومتكررة خلال ثقافة طويلة الأجل من شرائح المخ في نظام مغلق
Summary
قدم هنا طريقة أنبوب اسطوانة معدلة لاستزراع وتصوير عالي الدقة متقطعة من الدماغ القوارض شرائح الأسابيع كثيرة مع إعادة تنظيم دقيق في كوفيرسليبس فوتوتشيد. كذلك يتم الاحتفاظ بصلاحية الخلايا العصبية ومورفولوجيا شريحة. يتم توفير تطبيقات هذا النظام مغلق تماما استخدام الفيروسات للتعبير نوع من الخلايا المحددة.
Abstract
شرائح الدماغ القوارض مثقف مفيدة لدراسة سلوك الخلايا العصبية وإطلاق في بيئة التي يحتفظ العديد من تفاعلاتها طبيعية في فيفو الخلوية والجزيئية. الشرائح التي تم الحصول عليها من مجموعة متنوعة من خطوط الماوس المحورة وراثيا أو استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة أو الصحفيين في شرائح الدماغ نوع البرية السماح للتصوير عالي الدقة بالفحص المجهري الأسفار. على الرغم من أن قد وضعت عدة طرق لتصوير شرائح المخ، الجمع بين الثقافة شريحة مع القدرة على القيام بتصوير عالي الدقة المتكررة من خلايا معينة في شرائح حية على مدى فترات زمنية طويلة قد يطرح مشاكل. وهذا ينطبق بشكل خاص عند استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات الخارجية حيث يتم ذلك أفضل في نظام مغلق حماية المستخدمين ومنع حدوث التلوث المنتقل. ويفاد بسيطة التعديلات التي أدخلت على أسلوب ثقافة شريحة الدماغ أنبوب الاسطوانة التي تسمح بتصوير عالي الدقة المتكررة لشرائح على مدى أسابيع عديدة في نظام مغلق. استزراع شرائح في كوفيرسليبس فوتوتشيد يسمح باستخدام علامات الاعتماد لسرعة ودقة تعيين موضع مرحلة الصورة الميدانية متطابقة مع مرور الوقت قبل وبعد العلاجات المختلفة. وترد أمثلة لاستخدام هذا الأسلوب جنبا إلى جنب مع تلطيخ الخلايا العصبية المحددة والتعبير لمراقبة التغييرات في بنية شريحة هيبوكامبال والفيروسية بوساطة التعبير العصبية من البروتينات الفلورية وتطوير علم الأمراض كوفيلين، سابقا الذي لوحظ في قرن آمون لمرض الزهايمر (AD) ردا على معاملة الشريحة مع ليغومرات الببتيد اميلويد-بيتا (Aβ).
Introduction
الثقافة الأولية من الخلايا العصبية معزولة من مناطق الدماغ القوارض هو أداة هامة يستخدمها الباحثون لمراقبة الردود على مرضية المتورطين المحفزات. غير أن هذه الدراسات قد عيب تبحث في الخلايا العصبية في 2D فقط ودون نظام الدعم لهم الدبقية. وعلاوة على ذلك، إلا إذا نمت في ظروف كثافة عالية جداً (640 الخلايا العصبية/مم2 أو حوالي 16% من المساحة السطحية) الذي يصبح من المستحيل متابعة ثمرة عشوائية تغصن أو إكسون لأكثر من مسافة قصيرة من جهازها الخليوي، هيبوكامبال صلاحية الخلايا العصبية أكثر من 4 أسابيع انخفاضات كبيرة1، الحد من استخدام الثقافات معزولة لإجراء دراسات موسعة للأمراض المرتبطة بالسن. استزراع شرائح أعدت من الدماغ القوارض هو خيار جذاب أن يتغلب على هذه القيود من خلال الحفاظ العمارة خلية المنظمة وقدرتها على البقاء لأسابيع أو أشهر. وكانت الظروف للحفاظ على العديد من مناطق مختلفة من الدماغ القوارض في ثقافة شريحة وصف2.
اثنين من الأساليب الرئيسية تستخدم على نطاق واسع لثقافة طويلة الأجل من شرائح المخ: يسمح لتدوير في حاضنة اسطوانة توفير تهوية4استزراع على الأغشية في واجهة الهواء السائل3 أو استزراع في كوفيرسليبس في أنابيب محكمة الإغلاق. يمكن تصويرها شرائح مثقف على الأغشية مباشرة مع الفحص المجهري الفلورية العالية الاستبانة استخدام مجهر تستقيم والماء الغمر الأهداف5. بدلاً من ذلك، تم نقل شرائح مثقف في الأغشية للزجاج أسفل الأطباق التوصل إلى حل جيد للعمود الفقري الجذعية استخدام مجهر مقلوب6. ومع ذلك، كلا أساليب التصوير شرائح نمت على الأغشية هي النظم المفتوحة التي تتطلب التغييرات متوسطة، وغالباً ما تستخدم مضاد و/أو المضادات الحيوية لمنع أو الحد من تلوث5،6. الشرائح في غشاء في الواجهة الجوية المتوسطة الحفاظ على مورفولوجيا ممتازة والبقاء على قيد الحياة، ولكن العودة إلى المواقع بدقة أثناء التصوير المتكرر في تضخم عالية من الصعوبة ما لم يتابع التجربة مجموعات صغيرة فقط من الخلايا وإذ تعرب عن علامة نيون. على الرغم من أن قد استخدمت شرائح نمت على الأغشية مع التعبير الفيروسية بوساطة من المتسلسلات5،6، بروتوكولات السلامة الأحيائية قد تتطلب ستستخدم نظام ثقافة مغلقة لبعض النواقل الفيروسية التي يتم استخدامها من أجل وإذ تعرب عن فلوريسسينتلي معلم البروتينات والصحفيين لفيزيولوجيا الخلية. وعلاوة على ذلك، تتطلب أهداف الغمر إزالة التلوث بين العينات التي سيتم اتباعها في الثقافة5. تطبيق الرئيسية واحد من الغشاء واجهة الثقافات هو الجمع بين التصوير عالي الدقة مع الكهربية في وقت واحد النقاط7.
لا يسمح الأسلوب أنبوب الاسطوانة مع كوفيرسليبس داخل أنبوب بلاستيكي أي الكهربية أو تصوير عالي الدقة دون إزالة ساترة. وهكذا طبق هذا الأسلوب في أغلب الأحيان للدراسات الطويلة الأجل التي جعلت الملاحظات التثبيت بعد8. الموصوفة هنا هو طريقة التي يستخدم تقنية الثقافة أنبوب الاسطوانة ولكن المحافظة على أنابيب حفر السحب مع شرائح في كوفيرسليبس التي يمكن تصويرها متكررة لطالما الثقافات. يتطلب أي تغيير متوسطة لتصوير نظام مغلق ويستخدم كوفيرسليبس فوتويتشيد لتقديم علامات الاعتماد التي تسمح للتصوير في تضخم عالية، بعد أيام أو أسابيع، حقول محددة سبق تصويرها.
نقوم بتطبيق هذا الأسلوب لدراسة التغيرات في الحصين القوارض، منطقة الدماغ رئيسية مشاركة في الذاكرة والتعلم. وكثيراً ما يتم دراستها الحصين القوارض كنموذج للتغيرات المرضية أو المرتبطة بالسن التي لوحظت أثناء التطوير من ضعف الإدراك9، مثل تلك التي تحدث في الإعلان. أسلوبنا مناسبة خاصة لدراسة التغييرات المرضية التي تضع ضمن شريحة واحدة على مر الزمن في الاستجابة للتغيرات البيئية، مثل الزيادات في الببتيدات Aβ، التي من سمات AD8. وهو أحد الأمراض المرتبطة بالإنسان والقوارض الدماغ الإعلانية وجود المجاميع كوفيلين-أكتين وقضبان، الحزم التي تحتوي على هذا الأخير من خيوط الأكتين وكوفيلين في 1:1 نسبة مولى10،11، 12-قضبان وقد لوحظت في الشرائح الثابتة الحصين الفئران بعد العلاج Aβ، وكذلك ضمن شريحة الدماغ القوارض يعيش معربا عن التعرض لنقص8كوفيلين-بروتينات فلورية خضراء، وأنها قد تسهم في اختلال وظيفي متشابك في الإعلان والسكتة الدماغية. هنا نستخدم هذا الأسلوب الجديد في تثقيف للالتزام بالوقت بالطبع والتوزيع داخل شرائح أعرب البروتينات الفلورية تشيميريك خارجية عشر أدخلت بأنواع مختلفة من الفيروسات. ثم نستخدم تعبيراً محدداً الخلايا العصبية لبناء كوفيلين مراسل لمتابعة وضع قضيب كوفيلين وأمراض الكلي في شرائح هيبوكامبال استجابة للعلاج مع ليغومرات Aβ القابلة للذوبان (Aβس).
Protocol
Representative Results
Discussion
الاسطوانة أنبوب الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لاستزراع طويلة الأجل وعالية الدقة تصوير حية من أنسجة المخ شرائح. مسألة رئيسية واحدة مع تقنية شريحة المطبق هنا في التركيب والصيانة لشرائح. الطلاء ساترة التي تدعم انضمام شريحة، تشجيع شريحة رقيق بتعزيز ثمرة نيوريتيس والهجرة من الخلايا خارج الشريحة?…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
