Mis à jour le rouleau Tube méthode d’imagerie Intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la Culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé
Summary
Présenté ici est la méthode du tube mis à jour le rouleau pour la culture et intermittent une imagerie du cerveau rongeur tranches sur plusieurs semaines avec un repositionnement précis sur couvre-objet en photodécoupe. Viabilité neuronale et la morphologie de la tranche sont bien entretenus. Sont prévues des adaptations de ce système entièrement fermé à l’aide de virus pour l’expression spécifique de type cellulaire.
Abstract
Coupes de cerveau de rongeurs cultivées sont utiles pour étudier le comportement moléculaire et cellulaire des neurones et des cellules gliales dans un environnement qui soutient plusieurs de leurs interactions normales en vivo . Tranches provenant d’une variété de lignées de souris transgéniques ou utilisation de vecteurs viraux pour l’expression des protéines fluorescent étiquetées ou reporters dans les coupes de cerveau de type sauvage permettent d’imagerie haute résolution en microscopie par fluorescence. Bien que plusieurs méthodes ont été développées pour l’imagerie des tranches de cerveau, alliant la culture tranche avec la capacité d’exécuter répétitives une imagerie de cellules spécifiques en tranches direct sur de longues périodes a posé des problèmes. Cela est particulièrement vrai lorsque les vecteurs viraux sont utilisées pour l’expression des protéines exogènes, puisque cela se fait mieux dans un système fermé pour protéger les utilisateurs et d’éviter toute contamination croisée. Nous rapportons des simples modifications apportées à la méthode de culture de rouleau tube cerveau tranche qui permettent pour l’imagerie haute résolution répétitive des tranches sur plusieurs semaines dans un système fermé. Cultivant les tranches sur des lamelles de photodécoupe permet l’utilisation de repères de rapidement et précisément repositionner la scène pour l’image du champ identique au fil du temps avant et après des traitements différents. Des exemples sont donnés pour l’utilisation de cette méthode combinée à une coloration neuronale spécifique et expression d’observer les changements dans l’architecture tranche hippocampe, expression neuronale induite par virale de protéines fluorescentes et le développement de la pathologie cofilin, qui a été précédemment observé dans l’hippocampe de la maladie d’Alzheimer (ma) en réponse au traitement de la tranche avec des oligomères de peptide amyloïde-β (Aβ).
Introduction
Des cultures primaires de neurones dissociés des régions du cerveau de rongeur sont un outil important utilisé par les chercheurs pour observer les réponses à pathologiquement impliqués des stimuli. Toutefois, ces études présentent l’inconvénient de regarder les neurones en 2D uniquement et sans leur système de soutien glial. En outre, sauf s’il est cultivé dans des conditions de très haute densité (640 neurones/mm2 ou environ 16 % de la surface) dans lequel il devient impossible de suivre l’excroissance au hasard d’une dendrite ou axone depuis plus d’une courte distance de son corps cellulaire, hippocampe viabilité neuronale pendant 4 semaines diminue de façon importante1, limitant l’utilisation de cultures dissociées des études étendues des pathologies liées au vieillissement. La mise en culture des tranches préparés à partir de cerveau de rongeur est une option intéressante qui permet de surmonter ces limitations en conservant une architecture cellulaire organisés et la viabilité des semaines ou des mois. Conditions pour le maintien de nombreuses régions du cerveau de rongeur dans la tranche de culture ont été décrits2.
Deux méthodes principales sont largement utilisés pour les cultures à long terme des tranches de cerveau : culture sur la membrane à l’ interface air-liquide3 ou mise en culture sur les lamelles dans des tubes scellés a permis de tourner dans un incubateur à rouleau d’aération4. Tranches sur des membranes peuvent être photographiées directement avec la microscopie de fluorescence à haute résolution à l’aide d’un microscope droit et eau immersion objectifs5. Alternativement, tranches cultivés sur les membranes ont été transférés à la vaisselle en verre bas pour atteindre la bonne résolution des épines dendritiques, à l’aide d’un microscope inversé6. Toutefois, les deux méthodes d’imagerie tranches cultivés sur les membranes sont des systèmes ouverts qui nécessitent des modifications moyennes et utilisent souvent les antifongiques et/ou des antibiotiques pour prévenir ou réduire la contamination5,6. Tranches sur une membrane à l’interface air-médium maintiennent excellente morphologie et la survie, mais revenir à des emplacements précis en imagerie répétitive à fort grossissement est extrêmement difficile à moins que l’expérience est issue uniquement de petits groupes de cellules exprimant un marqueur fluorescent. Bien que les tranches cultivés sur les membranes ont été utilisés avec virale véhiculée par expression de transgènes5,6, protocoles de prévention des risques biotechnologiques peuvent nécessiter un système de culture clos être employées pour certains vecteurs viraux qui sont utilisés pour exprimant fluorescent étiquetée protéines et reporters de la physiologie cellulaire. En outre, les objectifs à immersion exigent décontamination entre les échantillons qui seront suivies dans la culture5. Une application importante des cultures interface membrane est de combiner une imagerie avec l’électrophysiologie de temps unique points7.
La méthode du tube à rouleaux avec lamelles couvre-objet à l’intérieur du tube en plastique ne permet pas de n’importe quel électrophysiologie ou l’imagerie haute résolution sans enlever le couvre-objet. Ainsi, cette méthode a été le plus souvent appliquée à des études à long terme dans lequel, après fixation observations ont été faites à8. Décrite ici est une méthode qui utilise la technique de culture de tube de rouleau, mais sur les tubes percés-out avec des tranches sur lamelles couvre-objet qui peut être photographiée de façon répétitive pour aussi longtemps que les cultures est maintenue. Le système clos ne requiert aucun changement médiatique pour l’imagerie et utilise des lamelles de photodécoupe pour fournir des repères qui permettent d’imagerie à fort grossissement, après quelques jours ou semaines, les domaines précis précédemment imagés.
Nous appliquons cette méthode pour analyser les changements dans l’hippocampe de rongeur, une région de majeur du cerveau impliquée dans la mémoire et l’apprentissage. L’hippocampe rongeur est souvent étudiée comme modèle pour des changements pathologiques ou liée à l’âge observée au cours du développement de troubles cognitifs9, telles que celles qui se produisent dans l’AD. Notre méthode est particulièrement bien adaptée à l’étude des changements pathologiques qui se développent au sein d’une seule tranche au fil du temps en réponse aux changements environnementaux, tels que l’augmentation des peptides bêta-amyloïdes, qui est caractéristique de l’AD8. Une pathologie associée du cerveau humain et les rongeur est la présence d’agrégats de cofilin-actine et tiges, les faisceaux contenant ce dernier des filaments dans laquelle cofilin et l’actine sont dans un rapport molaire 1:110,11, 12. tiges ont été observés dans les tranches fixes d’hippocampe de rat après un traitement de bêta-amyloïdes, ainsi que dans une tranche de cerveau de rongeurs vivants exprimant cofilin-GFP, soumis à l’hypoxie,8, et ils peuvent contribuer à la dysfonction synaptique chez AD et d’AVC. Ici, nous utilisons cette nouvelle méthode de culture pour observer l’évolution temporelle et la distribution dans les tranches des exogènes chimériques fluorescentes protéines exprimées introduites par différents virus. Ensuite, nous utilisons l’expression neuronale spécifique d’une construction de journaliste cofilin pour suivre l’évolution de la tige de cofilin et pathologie globale dans des tranches d’hippocampe en réponse au traitement par solubles oligomères bêta-amyloïdes (Aßo).
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode du tube rouleau décrite ici permet de culture à long terme et une imagerie direct du tissu cérébral en tranches. Un problème majeur avec la technique de tranche appliquée ici est dans le montage et l’entretien des tranches. Revêtements de lamelle qui prennent en charge la tranche adhérence, promouvoir l’amincissement de la tranche en améliorant l’excroissance des neurites et la migration des cellules hors la tranche ; ainsi, nous avons évité l’utilisation de ces substrats. L’insertion de…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
