Modifierade rulle Tube metod för just lokaliserade och repetitiva Intermittent avbildning under långtidsodling av hjärnan skivor i ett slutet rörsystem
Summary
Presenteras här är en modifierad rulle tube metod för odling och intermittent högupplöst avbildning av gnagare hjärnan skivor under många veckor med precisa ompositionering på photoetched coverslips. Neuronala livskraft och slice morfologi är väl underhållna. Tillämpningar av detta helt slutna system med virus för celltyp specifika uttryck tillhandahålls.
Abstract
Odlade gnagare hjärnan skivor är användbara för att studera cellulära och molekylära beteendet hos nervceller och glia i en miljö som har bevarat många av deras normala in-vivo -interaktioner. Skivor som erhållits från en mängd transgena möss linjer eller användning av virala vektorer för uttryck av fluorescently märkta proteiner eller reportrar i vildtyp hjärnan skivor möjliggör högupplöst avbildning genom fluorescensmikroskopi. Även om flera metoder har utvecklats för imaging hjärnan skivor, kombinera segment kultur med förmågan att utföra har repetitiva högupplöst avbildning av specifika celler i levande skivor över långa tidsperioder inneburit problem. Detta gäller särskilt när virala vektorer används för uttryck av exogena proteiner eftersom detta görs bäst i ett stängt system att skydda användare och förhindra korskontaminering. Enkla ändringar som gjorts till metoden rulle tube hjärnan slice kultur som möjliggör repetitiva högupplöst avbildning av skivor under många veckor i ett slutet rörsystem redovisas. Odling skivor på photoetched coverslips tillåter användning av relaterat märken snabbt och precist flytta scenen för att bild fältet identisk med tiden före och efter olika behandlingar. Exempel visas för användning av denna metod kombineras med specifika neuronala färgning och uttryck att iaktta förändringar i hippocampus bit arkitektur, viral-medierad neuronala uttrycket av fluorescerande proteiner och utvecklingen av cofilin patologi, som observerades tidigare i hippocampus vid Alzheimers sjukdom (AD) i behandlingssvaret skiva med oligomerer av β-amyloid (Aβ) peptid.
Introduction
Primära kultur av dissocierade nervceller från regioner i hjärnan som gnagare är ett viktigt verktyg som används av forskare för att följa Svaren till patologiskt inblandad stimuli. Sådana studier har dock nackdelen med tittar på nervceller i bara 2D och utan deras gliaceller stödsystem. Dessutom, såvida inte odlas under förhållanden med mycket hög densitet (640 nervceller mm2 eller ca 16% av ytan) där det blir omöjligt att följa den slumpmässiga utväxten av en dendrite eller axon för mer än ett kort avstånd från sin cell kropp, Hippocampus neuronala lönsamhet minskar under 4 veckor avsevärt1, begränsa användningen av dissocierade kulturer för utökade studier av åldersrelaterade sjukdomar. Odling av skivor beredd från gnagare hjärnan är ett attraktivt alternativ som övervinner dessa begränsningar genom att upprätthålla en organiserad cell arkitektur och livskraft i veckor eller månader. Villkor för att upprätthålla många olika regioner av gnagare hjärnan i slice kultur har varit beskrivs2.
Två stora metoder används allmänt för långtidsodling av hjärnan skivor: odling på membran på luft-vätska gränssnitt3 eller odling på coverslips i förslutna rör tillåtet för att rotera i en rulle inkubator att ge luftning4. Skivor som odlade på membran kan avbildas direkt med högupplöst fluorescensmikroskopi använder ett upprätt Mikroskop och water immersion mål5. Alternativt, skivor odlade på membran har överförts till glas botten rätter att uppnå bra upplösning av Dendritutskotten använder en inverterade mikroskopet6. Båda metoderna för imaging skivor odlas på membran är dock öppna system som kräver medium ändringar och använder ofta svampdödande och/eller antibiotika för att förhindra eller minska föroreningar5,6. Skivor på ett membran på gränssnittet luft-medium upprätthålla utmärkt morfologi och överlevnad, men tillbaka till exakta platser under repetitiva imaging med hög förstoring är extremt svårt om experimentet är efter bara små grupper av celler uttrycker en fluorescerande markör. Även om skivor som odlas på membran har använts med viral-medierade uttryck av transgener5,6, kan biosäkerhet protokoll kräva ett medföljande kultur-system användas för vissa virala vektorer som används för uttrycka fluorescently märkta proteiner och reportrar av cellfysiologi. Dessutom kräver nedsänkning målen sanering mellan prover som kommer att följas i kultur5. En viktig tillämpning av membran gränssnitt kulturer är att kombinera hög upplösning imaging med elektrofysiologi vid gång punkterna7.
Metoden rulle tube med coverslips inuti plast röret tillåter inte någon elektrofysiologi eller högupplöst avbildning utan att ta bort täckglaset. Således, denna metod har tillämpats oftast att långtidsstudier där efter fixering observationer har gjorts8. Beskrivs här är en metod som utnyttjar den rulle tube kultur tekniken men på borrade ut rör med skivor på coverslips som kan avbildas upprepade så länge som kulturerna bibehålls. Det slutna systemet kräver ingen medium förändring för avbildning och utnyttjar photoetched coverslips för att ge relaterat märken som tillåter imaging med hög förstoring, efter dagar eller veckor, fälten exakt tidigare avbildade.
Vi tillämpar denna metod för att undersöka förändringar i gnagare hippocampus, en större hjärnregionen som deltar i minne och inlärning. Gnagare hippocampus studeras ofta som en modell för patologiska eller åldersrelaterade förändringar som observerats under utvecklingen av kognitiv svikt9, till exempel de som uppstår i AD. Vår metod är särskilt väl lämpade att studera sjukliga förändringar som utvecklas inom en cirkelsektor över tid i Svaren till miljöförändringar, såsom ökning av Aβ peptider, vilket är karaktäristiskt för AD8. En patologi är associerad med mänskliga och gnagare AD hjärna är förekomsten av cofilin-aktin aggregat och spön, de senare som innehåller buntarna av filament som cofilin och aktin är en 1:1 molar förhållandet10,11, 12. stavar har observerats i fasta skivor av råtta hippocampus efter Aβ behandling, liksom inom en levande gnagare hjärnan slice uttrycker cofilin-GFP utsätts för hypoxi8, och de kan bidra till synaptic dysfunktion ses i AD och stroke. Här använder vi denna nya culturing metod för att observera fördelningen inom skivor av uttryckt exogena chimära fluorescerande proteiner infördes genom olika virus och tidsförlopp. Vi använder sedan det neuronala specifika uttrycket av en cofilin reporter konstruktion att följa utvecklingen av cofilin spö och sammanlagda patologi i hippocampus skivor svar på behandling med lösliga Aβ oligomerer (Aβo).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den rulle tube metod som beskrivs här ger långsiktig odling och högupplösta levande avbildning av skivad hjärnvävnad. En viktig fråga med slice teknik som tillämpas här är i montering och underhåll av skivor. Täckglas beläggningar som stöder slice vidhäftning, främja slice gallring genom att förbättra utväxten av neuriter och migration av celler ur segmentet; därmed undvek vi användning av dessa substrat. Införandet av aminogrupper på glaset genom behandling med 3-aminopropyltrietoxisilan förbätt…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
