कक्ष पत्रकों के माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए डॉट परख का उपयोग करना
Summary
कोशिका प्रवास विकास के लिए आवश्यक है, ऊतक रखरखाव और मरंमत, और tumorigenesis, और विकास कारकों द्वारा विनियमित है, chemokines, और साइटोकिंस । इस प्रोटोकॉल का वर्णन डॉट परख, एक दो आयामी, स्वैच्छिक प्रवास परख के प्रवासी phenotype का आकलन करने के लिए संलग्न, microenvironmental cues के जवाब में एकजुट सेल चादरें ।
Abstract
हालांकि जटिल जीवों स्थिर दिखाई देते हैं, उनके ऊतकों एक सतत कारोबार के तहत कर रहे हैं । कोशिकाओं के रूप में उंर, मरो, और नई कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं, कोशिकाओं को एक कसकर आर्केस्ट्रा तरीके से ऊतकों के भीतर ले जाते हैं । ट्यूमर के विकास के दौरान, इस संतुलन परेशान है, और ट्यूमर कोशिकाओं के मूल उपकला छोड़ स्थानीय microenvironment आक्रमण करने के लिए, सुदूर स्थलों की यात्रा करने के लिए, और अंत में दूर साइटों पर मेटास्टेटिक ट्यूमर फार्म । डॉट परख एक सरल, दो आयामी स्वैच्छिक प्रवास परख है, के लिए एक सेल में सेल शीट्स के नेट आंदोलन मुक्त क्षेत्र का आकलन है, और सेल प्रवास के मापदंडों का विश्लेषण समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर । यहां, डॉट परख एक मानव इनवेसिव, फेफड़े के स्तन कैंसर सेल लाइन, MCF10CA1a, बनाने के लिए ‘ कोशिकाओं प्रवासी एपिडर्मल वृद्धि फैक्टर (EGF) है, जो स्तन कैंसर की कोशिकाओं के घातक क्षमता बढ़ाने के लिए जाना जाता है प्रतिक्रिया का विश्लेषण कालोनी का उपयोग कर प्रदर्शन किया है और कोशिकाओं के प्रवासी phenotype को झूमने पर मजबूर कर दिया ।
Introduction
प्रवास परख व्यापक रूप से इन विट्रो मेंट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक और मेटास्टेटिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है । सबसे अधिक, घाव या खरोंच परख एक सेल में उपकला चादरें के प्रवास का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है क्षेत्र को मंजूरी दे दी1,2,3। करने के लिए खरोंच परख प्रदर्शन, कोशिकाओं को एक monolayer में चढ़ाया जाता है और एक “खरोंच” या सेल मुक्त क्षेत्र एक पिपेट टिप के साथ बनाया जाता है । खरोंच परख के लिए सामांयतः उपलब्ध ऊतक संस्कृति की आपूर्ति के साथ स्थापित आसान है और बहु में प्रदर्शन किया जा सकता है अच्छी तरह से प्लेटें, कई नमूनों के प्रसंस्करण के लिए अनुमति दी । हालांकि, खरोंच के रूप में किया जाता है, कोशिकाओं को शारीरिक रूप से monolayer से हटा दिया जाता है और अक्सर कोशिका मृत्यु से गुजरना । इसके अलावा, extracellular मैट्रिक्स प्लेट से जुड़ी अक्सर scratching प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त है । इसी तरह, सिलिकॉन आवेषण का उपयोग (जैसे Ibidi चेंबर्स4के रूप में) या stencils5,6,7 कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन और मैट्रिक्स के आंशिक हटाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं प्रोटीन कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया प्लेट. एक और नुकसान की परख की निगरानी बंद करने के घावों या खरोंच उनके सीमित समय पाठ्यक्रम है, के रूप में सेल प्रवास ही विश्लेषण किया जा सकता है जब तक खरोंच बंद है ।
डॉट परख प्रदर्शन में, कोशिकाओं एक लेपित या unकोट प्लेट8पर एक परिपत्र कॉलोनी के रूप में चढ़ाया जाता है । इस चढ़ाना रणनीति के लिए तर्क को परिभाषित किनारों के साथ सेल शीट प्राप्त है, कि पलायन या कोशिकाओं या आवेषण के हटाने से संस्कृति परेशान बिना आसपास के सेल मुक्त क्षेत्रों में आक्रमण कर सकते हैं । डॉट परख के समग्र लक्ष्य को सेल शीट के प्रवास के रूप में बढ़त विस्थापन या कॉलोनी व्यास, के रूप में अच्छी तरह के रूप में समय-चूक इमेजिंग करने के लिए उच्च spatio-लौकिक संकल्प में कोशिकाओं के प्रवासी phenotype का विश्लेषण करने के लिए मापा निरीक्षण है ।
सेल प्रवासन chemokines, साइटोकिंस जैसे microenvironmental cues की एक किस्म से प्रभावित हो सकते हैं, और EGF जैसे विकास कारकों । EGF एक वृद्धि कारक है कि इसकी रिसेप्टर, EGF रिसेप्टर9के लिए बाध्यकारी के माध्यम से अपने जैविक प्रभाव डालती है, और ट्यूमर कोशिकाओं के4,9,10के आक्रामक और मेटास्टेटिक व्यवहार बढ़ जाती है. यहां, डॉट परख एक मानव इनवेसिव में सेल प्रवास उत्तेजित EGF अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, फेफड़ों स्तन कैंसर सेल लाइन (MCF10CA1a)8,11,12बनाने कॉलोनी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमर प्रगति कोशिकाओं के दौरान आसपास के ऊतकों और metastasize दूर साइटों के लिए आक्रमण करने के लिए मूल के ऊतक से दूर पलायन15. सेल कॉलोनी से दूर कोशिकाओं के प्रवास को डॉट परख में देखा जा सकता है । इधर, डॉट ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक को पढ़ने और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Bhagawat सुब्रह्मण्यम, यी (जेसन) चांग, पॉल Randazzo, और Carole जनक शुक्रिया अदा करना चाहता है । इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने समर्थन दिया था.
Materials
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for asay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid ) | Cayman | 10093 | used to stimulate cells |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for LPA and EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
Referências
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