Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren
Summary
Zellmigration ist entscheidend für Entwicklung, Gewebe-Wartung und Reparatur und Tumorgenese und wird durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine reguliert. Dieses Protokoll beschreibt Dot-Test, eine zweidimensionale, ungezwungene Migration Assay den wandernden Phänotyp der beigefügten, geschlossene Zelle Blätter als Reaktion auf microenvironmental Hinweise zu beurteilen.
Abstract
Auch wenn komplexe Organismen statisch erscheinen, sind ihre Gewebe unter einem kontinuierlichen Umsatz. Als Alter Zellen, bewegen sterben und werden durch neue Zellen ersetzt Zellen in den Geweben in gewissem Sinne dicht orchestrierte. Während der Entwicklung von Tumoren ist dieses Gleichgewicht gestört, und Tumorzellen lassen das Epithel des Ursprungs, der lokalen Mikroumgebung, ferne Orte bereisen und bilden schließlich metastasierten Tumoren an entfernten Standorten zu erobern. Die Dot-Assay ist ein einfache, zweidimensionale ungezwungene Migration Assay, Nettobewegung Zelle Blätter in einem zellfreien Bereich bewerten und Parameter der Zellwanderung mit Zeitraffer-Bildgebung zu analysieren. Hier der Dot-Test zeigt sich mit einem menschlichen invasive, Lunge koloniebildenden Brust-Krebs-Zell-Linie, MCF10CA1a, wandernden Reaktion der Zellen auf epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), analysieren die bekannt ist, bösartige Potenzial von Brustkrebs-Zellen zu erhöhen und die wandernden Phänotyp der Zellen ändern.
Introduction
Migration-Assays sind weit verbreitet, die invasive und metastatische Potential der Tumor Zellen in Vitrozu bewerten. Am häufigsten wird die Wunde oder Kratzer Assay verwendet, um Migration von epithelialen Blätter in eine Zelle gelöscht Bereich1,2,3bewerten. Um der Scratch-Test durchzuführen, sind Zellen in einem monomolekularen Film beschichtet und einen “Kratzer” oder zellfreie Bereich wird mit einer Pipettenspitze erstellt. Der Scratch-Test ist einfach mit handelsüblichen Gewebekultur Lieferungen einzurichten und im Multi-well-Platten, so dass für die Verarbeitung mehrerer Proben durchgeführt werden kann. Jedoch da der Kratzer hergestellt wird, Zellen sind physisch aus der Monolage entfernt und oft durchlaufen Zelltod. Extrazellulärer Matrix an der Platte befestigt ist darüber hinaus oft kratzen dabei beschädigt. Ebenso die Verwendung von Silizium wird eingefügt (z. B. Ibidi Kammern4) oder Schablonen5,6,7 zu mechanischen Störungen der Zellen und der teilweisen Entfernung der Matrixproteine Beschichtung führen die Platten. Ein weiterer Nachteil von Assays Überwachung Verschluss von Wunden oder Kratzer ist ihre begrenzte Zeit natürlich da Zellwanderung nur analysiert werden kann, bis der Kratzer geschlossen wird.
Bei der Durchführung des Dot-Tests, sind Zellen als eine kreisförmige Kolonie auf einer beschichteten oder unbeschichteten Platte8vergoldet. Die Gründe für diese Beschichtung-Strategie soll Zelle Blätter mit definierten Kanten zu erhalten, die dringen in die Zelle-freie Umgebung ohne zu stören die Kultur durch Abbau von Zellen oder Beilagen oder migrieren können. Das übergeordnete Ziel des Dot-Assays ist Migration der Zelle Blätter gemessen am Rande Verschiebung oder Kolonie Durchmesser, sowie hinsichtlich durchführen, Time-Lapse imaging zu analysieren, die wandernden Phänotyp der Zellen in räumlich-zeitliche Auflösung beobachten.
Zellwanderung kann durch eine Vielzahl von microenvironmental Signale wie Chemokine, Zytokine und Wachstumsfaktoren wie EGF beeinträchtigt werden. EGF ist ein Wachstumsfaktor, der übt seine biologische Wirkung über Bindung an seinen Rezeptor EGF-Rezeptor-9, und invasive und metastasierten Verhalten von Tumor Zellen4,9,10erhöht. Hier ist der Dot-Test zur Untersuchung EGF stimuliert Zellwanderung in eine menschliche invasive, Lunge koloniebildenden Brust Krebs Zelle Linie (MCF10CA1a)8,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migrieren Sie bei Fortschreiten der Tumorzellen vom Gewebe des Ursprungs das umliegende Gewebe einzudringen und Metastasen in entfernten Standorten15. Wanderung von Zellen von einer Zelle Kolonie kann in der Dot-Probe beobachtet werden. Hier ist der Dot-Test dargestellt, durch die Analyse des wandernden Phänotyps von menschlichen Brustkrebszellen in Reaktion auf EGF.
Um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten mehrere Schritte bei der Einrichtung des Punktes s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor bedankt sich bei Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo und Carole Parent fürs Lesen und kommentieren auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Intramurale Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for asay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid ) | Cayman | 10093 | used to stimulate cells |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for LPA and EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
Referências
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