Usando l'analisi di Dot per analizzare la migrazione degli strati delle cellule
Summary
Migrazione delle cellule è essenziale per lo sviluppo, manutenzione dei tessuti e riparazione e tumorigenesi ed è regolata da fattori di crescita, chemochine e citochine. Questo protocollo descrive il dosaggio di dot, un’analisi bidimensionale, senza vincoli di migrazione per valutare il fenotipo migratore di strati delle cellule allegata, coesa in risposta a stimoli microambientali.
Abstract
Anche se gli organismi complessi appaiono statici, i loro tessuti sono sotto un continuo turnover. Come cellule età, muoiono e sono sostituite da nuove cellule, cellule spostano all’interno dei tessuti in maniera ben orchestrata. Durante lo sviluppo del tumore, questo equilibrio è disturbato, e lasciano le cellule del tumore dell’epitelio di origine per invadere il microambiente locale, viaggiare in luoghi distanti e in definitiva formare tumori metastatici ai luoghi distanti. Il metodo di dot è un semplice, bidimensionale migrazione senza vincoli, per valutare il movimento netto di strati delle cellule in una zona senza cellula e per analizzare i parametri della migrazione cellulare usando la formazione immagine di time-lapse. Qui, il dosaggio di dot è dimostrato utilizzando un umani dilaganti, la linea cellulare del cancro al seno, MCF10CA1a, di formazione di colonie di polmone per analizzare la risposta migratoria delle cellule di fattore di crescita epidermico (EGF), che è noto per aumentare il potenziale maligno delle cellule di cancro al seno e per modificare il fenotipo migratorio delle cellule.
Introduction
Saggi di migrazione sono ampiamente utilizzati per valutare il potenziale invasivo e metastatico delle cellule del tumore in vitro. Più comunemente, la ferita o dosaggio zero viene utilizzato per valutare la migrazione epiteliale fogli in una cella deselezionata zona1,2,3. Per eseguire l’analisi di gratta e Vinci, le cellule sono placcate in un monostrato e un “graffio” o zona senza cellula viene creato con un puntale. Il dosaggio zero è facile da configurare con i rifornimenti di coltura del tessuto comunemente disponibili e possa essere eseguito in piastre multi-pozzetto, permettendo per la lavorazione dei campioni multipli. Tuttavia, come è fatto il graffio, cellule sono fisicamente da strato monomolecolare e spesso subiscono la morte delle cellule. Inoltre, fissato alla piastra di tabella extracellulare è spesso danneggiata durante il processo di graffio. Allo stesso modo, l’uso di silicone inserti (ad esempio Ibidi chambers4) o degli stampini5,6,7 può portare alla rottura meccanica delle cellule e la parziale rimozione delle proteine della matrice utilizzato per il rivestimento del piatti. Un altro svantaggio delle analisi monitoraggio della chiusura delle ferite o graffi è loro corso di tempo limitato, come la migrazione delle cellule può essere analizzata solo fino a quando il graffio è chiuso.
Nell’esecuzione del saggio di dot, le cellule sono placcate come Colonia circolare su una piastra con o senza rivestimento8. La spiegazione razionale per questa strategia di placcatura è di ottenere strati delle cellule con bordi definiti, che possono migrare o invadere nelle zone circostanti senza cellula senza disturbare la cultura tramite rimozione di cellule o inserti. L’obiettivo generale del dosaggio dot è di osservare la migrazione degli strati delle cellule misurata dal bordo spostamento o diametro di Colonia, nonché eseguire imaging time-lapse per analizzare il fenotipo migratorio delle cellule in alta risoluzione spazio-temporale.
Migrazione delle cellule può essere influenzata da una varietà di stimoli microambientali come chemochine, citochine e fattori di crescita come EGF. L’EGF è un fattore di crescita che esercita i suoi effetti biologici attraverso il legame al suo recettore, il recettore di EGF9e aumenta il comportamento invasivo e metastatico del tumore le cellule4,9,10. Qui, il dosaggio di dot è usato per studiare EGF stimolata migrazione cellulare in una colonia umana di polmone per il dilagante, formando al seno cancro cella linea (MCF10CA1a)8,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante le cellule di progressione del tumore migrano dal tessuto di origine di invadere il tessuto circostante e riprodurrsi per metastasi ai siti distanti15. Migrazione delle cellule da una colonia di cellule può essere osservato nell’analisi della dot. Qui, il dosaggio di dot è illustrato analizzando il fenotipo migratorio delle cellule di cancro al seno umano in risposta a EGF.
Per ottenere risultati accurati e riproducibili diverse fasi d’impostazione del punto s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’autore desidera ringraziare Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo e Carole Parent per lettura e il commento sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for asay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid ) | Cayman | 10093 | used to stimulate cells |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for LPA and EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
Referências
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