De Madagaskar Sissende kakkerlak als een alternatieve bij niet-zoogdieren diermodel te onderzoeken Drug werkzaamheid, virulentie en pathogenese
Summary
Presenteren we een protocol voor het gebruik van de Madagaskar Sissende kakkerlak als een alternatieve bij niet-zoogdieren diermodel uit te voeren van bacteriële virulentie, pathogenese, drug toxiciteit, werkzaamheid van de drug en aangeboren immuunrespons studies.
Abstract
Vele aspecten van aangeboren immuniteit worden bewaard tussen zoogdieren en insecten. Een insect, de Madagaskar Sissende kakkerlak uit het geslacht Gromphadorhina, kan worden gebruikt als een alternatieve diermodel voor de studie van virulentie, host-pathogen interactions, aangeboren immuunrespons en werkzaamheid van het geneesmiddel. Details voor het fokken, verzorging en kweek van de Sissende kakkerlak worden geleverd. We illustreren ook hoe het kan worden besmet met bacteriën zoals de intracellulaire pathogenen Burkholderia mallei, B. pseudomallei, en B. thailandensis. Gebruik van de Sissende kakkerlak is goedkoop en overwint regelgevingskwesties omgaan met het gebruik van zoogdieren in onderzoek. Bovendien zijn resultaten gevonden met behulp van het Sissende kakkerlak model reproduceerbaar zijn en vergelijkbaar zijn met die verkregen met behulp van zoogdieren modellen. Dus, de Madagaskar Sissende kakkerlak vertegenwoordigt een aantrekkelijke surrogaat-host die bij het uitvoeren van dierproeven moet worden onderzocht.
Introduction
Het gebruik van insecten als alternatieve bij niet-zoogdieren diermodellen om bacteriële pathogenese en aangeboren host verdediging te studeren is het verkrijgen van dynamiek in de afgelopen jaren. Logistiek, komt dit door de relatief goedkope prijs en het gemak bij het verkrijgen, behandelen, en zorg voor insecten ten opzichte van zoogdieren. Er is ook geen regelgevende beleid inzake het gebruik van insecten in onderzoek; het is niet onderworpen aan de bevoegdheid of beperkingen uiteengezet door een dier gebruik Comité of regering agentschap. Insecten als surrogaat dierlijke modellen zijn bijzonder vatbaar voor alomvattende screening studies voor virulentiefactoren, gastheer-pathogeen interacties en beoordeling van de werkzaamheid van de anti-microbiële drug. Hun gebruik kan het verminderen van het aantal zoogdieren gebruikt voor onderzoek, waardoor het overwinnen van enkele van de ethische dilemma’s die inherent zijn aan de uitvoering van dierproeven 1,2.
Insecten kunnen dienen als surrogaat gastheren, omdat er een hoge mate van gemeenschappelijkheid tussen het aangeboren immuunsysteem voor insecten en zoogdieren 1,3. Zowel insecten plasmatocytes en zoogdieren macrofagen phagocytose micro-organismen 4. De insecten tegenhanger van de neutrofiele is de hemocyte 5,6. Intracellulaire oxidatieve burst trajecten in insect en zoogdiercellen lijken; reactieve zuurstof soorten in beide worden geproduceerd door orthologous p47phox en p67phox eiwitten 5. De signalering cascades stroomafwaarts van tol receptoren in insecten en Toll-like receptoren en Interleukin-1 bij zoogdieren zijn ook opvallend vergelijkbaar; beide leiden tot productie van antimicrobiële peptides, zoals defensinen 7. Dus, insecten kunnen worden gebruikt om algemene aangeboren immuun mechanismen die worden gedeeld door metazoans bestuderen.
Een insect genaamd de Madagaskar Sissende kakkerlak uit het geslacht Gromphadorhina, is een van de grootste kakkerlak soorten die bestaat, meestal 5 tot 8 cm bij rijpheid te bereiken. Het is inheems alleen op het eiland Madagaskar en wordt gekenmerkt door het sissende geluid maakt – een geluid dat wordt geproduceerd wanneer de Sissende kakkerlak verdrijft de lucht via de luchtwegen openingen spiracles 8genoemd. De kenmerkende gesis fungeert als een vorm van sociale communicatie tussen sissende kakkerlakken voor verkering en agressie 9 en kan worden gehoord als een man verstoord in zijn leefgebied wordt. De Madagaskar Sissende kakkerlak is traag bewegen ten opzichte van de Amerikaanse kakkerlak en andere soorten urban pest. Het is makkelijk te verzorgen en kweken; een zwangere Sissende kakkerlak kan produceren nakomelingen van 20 tot 30 op een moment. Een baby Sissende kakkerlak, een nimf, genaamd seksuele volwassenheid bereikt in 5 maanden na het ondergaan van 6 molts en kan waarmaken tot en met 5 jaar, zowel in het wild en in gevangenschap 8.
We hebben het gebruikt van de Madagaskar Sissende kakkerlak als surrogaat gastheer voor besmetting met de intracellulaire pathogenen Burkholderia mallei, B. pseudomallei, en B. thailandensis 10,11. De virulentie van deze ziekteverwekkers in het sissende kakkerlakken werd vergeleken met hun virulentie in de benchmark diermodel voor Burkholderia, de Syrische hamster. We vonden dat de 50% letale dosis (LD50) van B. pseudomallei pt B. mallei gelijkaardig in beide modellen 11was. Interessant, is B. thailandensis, hoewel Avirulente in het knaagdier model, dodelijk in de Sissende kakkerlak 11. Dit verschil ten opzichte van B. thailandensis infectie onderstreept het nut van het Sissende kakkerlak model; B. thailandensis verzachtende mutanten kunnen gemakkelijker worden opgelost in de Sissende kakkerlak dan in knaagdier modellen. Bovendien, zoals B. thailandensis vaak als gebruikt wordt de modelorganisme voor B. pseudomallei pt B. mallei 10,12,13, identificeren van geluidwerende mutaties in het kon leiden tot soortgelijke doelstellingen in zijn virulenter verwanten.
Ondanks het verschil in virulentie van B. thailandensis in de Sissende kakkerlak versus de Syrische hamster, mutaties in kritische virulentiefactoren, zoals die in de type 6 secretie systeem-1 (T6SS-1), die zijn verzachtende in B. mallei pt B. pseudomallei, zijn ook verzachtende voor B. thailandensis 11. Het Sissende kakkerlak model is verder gevalideerd in dat individuele T6SS mutanten (T6SS-2 T6SS-6) in B. pseudomallei, die geen invloed op de virulentie in Syrische hamsters hebben, virulente in de sissende kakkerlakken 11 blijven. De Sissende kakkerlak is dus een levensvatbare surrogaat diermodel voor de drie soorten Burkholderia . Wij onlangs de Sissende kakkerlak gebruikt als een surrogaat diermodel te onderzoeken van de werkzaamheid van de anti-malaria drug chloroquine (CLQ) tegen Burkholderia infectie 10 en de giftigheid.
Hier beschrijven we de opvoeding en verzorging van de Madagaskar Sissende kakkerlak en geven details over hoe dit insect met drie Burkholderia species infecteren. Bovendien, we illustreren dat de Sissende kakkerlak een levensvatbare surrogaat-model is te bestuderen de virulentie en drug werkzaamheid in Burkholderia infecties en dat het waarschijnlijk ook als een vervangend gastheer voor andere bacteriële pathogenen in soortgelijke studies dienen kan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimale proefomstandigheden begint met een gezonde Sissende kakkerlak kolonie, die een minimale maar consistent tijd inzet vereist. Hoewel sissende kakkerlakken kan gaan voor een relatief lange periode van tijd (~ weken) zonder voedsel en water, wekelijks of tweewekelijks kooi onderhoud moet worden verstrekt. Het gaat hierbij om controle van de voedsel- en watervoorziening en ervoor te zorgen dat de kooi droog is. Behoud van droge levensomstandigheden is vooral belangrijk tijdens de acclimatisatie en incubatie bij hoger…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer en A.M. Friedlander ontworpen de procedures die zijn beschreven in het manuscript. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli en D. DeShazer de experimenten uitgevoerd. J. Chua schreef het manuscript.
De auteurs bedanken Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter en Steven A. Tobery voor uitstekende technische bijstand en David P. Fetterer en Steven J. Kern voor statistische analyse.
Het werk werd gesteund door de verdediging bedreiging vermindering Agentschap voorstel #CBCALL12-THRB1-1-0270 #CBS te A.M.F. MEDBIO.02.10.rd.034 naar D.D.
Adviezen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteurs en zijn niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het Amerikaanse leger.
De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het ministerie van defensie, noch vermeldt van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties impliceren goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
Materials
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
Referências
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M., Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. . Cellular Microbiology. , 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary?. New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
