تجزئة سوبسيلولار للتنشيط إيرك عند معاملة الببتيد المستمدة من الميتوكوندريا
Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية حفز الخلايا مع الببتيدات المشتقة من الميتوكوندريا، وتقييم تتالي إرسال الإشارات والتعريب والرمات-البروتينات.
Abstract
الببتيدات المشتقة من الميتوكوندريا (مدبس) هي فئة جديدة من الببتيدات التي تم ترميزها بإطارات صغيرة للقراءة المفتوحة داخل جينات أخرى معروفة لجينوم المتقدرية. وقد مدبس طائفة واسعة من الآثار البيولوجية مثل حماية الخلايا العصبية من المبرمج، وتحسين علامات التمثيل الغذائي، وحماية الخلايا من العلاج الكيميائي. هومانين كان أول حزب الألفية الديمقراطي يمكن اكتشافها وهو الببتيد درس آخر بين أسرة حزب الألفية الديمقراطي. قد اتسمت بعناية مستقبلات الغشاء ومسارات الإشارات المتلقين للمعلومات من هومانين. مدبس إضافية مثل الكلمات-ج و SHLP1-6 وقد اكتشفت في الآونة الأخيرة ولم توضيح آليات إرسال الإشارات. هنا يمكننا وصف أسلوب ثقافة القائمة على خلايا لتحديد وظيفة هذه الببتيدات. على وجه الخصوص، تقنيات تجزئة الخلية في تركيبة مع النشاف الغربية يسمح بتحديد كمي للتنشيط وازفاء جزيء إشارات هامة. في حين أن هناك أساليب أخرى لتجزئة الخلية، الموضحة هنا طريقة سهلة ومباشرة. يمكن استخدام هذه الأساليب لتوضيح إليه العمل هذه الببتيدات والعوامل العلاجية الأخرى.
Introduction
وتبين الدراسات الناشئة أن الببتيدات المشتقة من الميتوكوندريا (مدبس) تلعب دوراً هاما في سيتوبروتيكشن والايض2،،من13. فهم المسار توصيل الإشارات حضور مدبس يعطينا نظرة ثاقبة الآلية التي تعدل مدبس وظائف مختلفة. الديمقراطي التي تم تحديدها أولاً، هومانين، قد ثبت أن زيادة خارج الخلية كيناز ينظم إشارة 1/2 (ERK1/2) الفسفرة من خلال مستقبلات لها ملزمة4،5. غير تأثير المصب التنشيط ERK1/2 لا يزال مستقصاة.
تتالي ERK1/2 يعمل كوسيط أساسي في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية بما في ذلك الانتشار والهجرة الخلية والايض الخلوي، والبقاء على قيد الحياة والمبرمج6،،من78. لتنسق جميع هذه العمليات الخلوية متميزة، والنشاط والتعريب سوبسيلولار ERK1/2 أحكام ينظم فوسفاتاسيس والسقالة البروتينات9،10. بالإضافة إلى تعديل بوستترانسلاشونال، جولات مكوكية دينامية ERK1/2 ينظم أيضا إرسال الإشارات الدالة، والنشاط، وخصوصية11،12. هو أساسا في سيتوسول13مترجمة ERK1/2. تساعد مجموعة من البروتينات وترسيخ سقالة الاحتفاظ ERK1/2 في العناصر سيتوسكيليتال، على السطح من العضيات، أو تنتشر في السيتوبلازم13. عند التحفيز، وهو فوسفوريلاتيد ERK1/2 ويصبح ينفصل ترسيخ البروتينات، مما يتيح نقل جسد ERK1/2 إلى المقصورات سوبسيلولار الأخرى، بما في ذلك نواة، الميتوكوندريا، غولجي، و، ليسوسوميس14 15 , 16.
على الرغم من أن من المعروف هومانين لتنشيط ERK1/2 يشير إلى المسار، فقط لوحظ أن تفعيل ERK1/2 في ليساتيس خلية الإجمالي. كما هو موضح سابقا، نظراً للترجمة سوبسيلولار ERK1/2 يلعب دوراً حاسما في أثره المتلقين للمعلومات، وتحليل التعريب سوبسيلولار ومستويات إجمالي فوسفوريلاتيد ERK1/2 ضروري لتوفير فهم شامل ERK1/2 التي يسببها هومانين التنشيط وتفعيل أهداف المتلقين للمعلومات.
فهم العضيات الهدف من تنشيط ERK1/2، تم إجراء تجزئة سوبسيلولار تليها النشاف الغربية فوسفوريلاتيد ERK1/2. ويمكن تنفيذ هذا الأسلوب بسهولة كما أنها تستخدم معدات المختبرات القياسية والكواشف. المقصورات سوبسيلولار معزولة بدرجة نقاء عالية، مما يسمح في النتائج التي تفسر بشكل مباشر. إيمونوستاينينج ERK1/2 قد تسفر عن نتائج مماثلة. بعض المقصورات سوبسيلولار غير الثابتة نسبيا لتصور وتتطلب أساليب التثبيت وبيرميبيليزيشن الخاصة. تختلف مستويات ERK1/2 في المقصورات سوبسيلولار، وهذا الاختلاف يمكن أن تسبب الإشارات السلبية إيجابية وكاذبة كاذبة عند النظر في كل خلية ليساتيس. ولذلك، إيمونوبلوت استخدام المقصورات سوبسيلولار معزولة يعطينا فهم أفضل للتعريب ERK1/2.
براعة الأسلوب الذي يتيح إدخال تعديلات على البروتوكول للتحقيق في آثار المنشطات الأخرى بما في ذلك أخرى مدبس أو إزفاء من جزيئات إشارات أخرى مثل STAT3. مؤخرا تم ترميزها المكتشفة الصغيرة مثل هومانين الببتيدات (شلبس) من منطقة الرنا الريباسي 16S حيث يتم ترميز هومانين، ولديهم خصائص مشابهة ولكنها متميزة بالمقارنة مع حماد17. على سبيل المثال، تنشيط SHLP2 و SHLP3 ERK1/2 بعد 8 س على الرغم من أن ينشط هومانين ERK1/2 ضمن الحد الأدنى 5 دراسة الترجمة سوبسيلولار ERK1/2 ردا على الببتيدات مختلفة سيتيح لنا فهم أفضل لعلم الأحياء من هذه الببتيدات. تظهر الأدلة أظهرت أن توطين سوبسيلولار مما يشير إلى جزيئات تلعب دوراً حاسما في آثارها المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، STAT3 المعروف تقليديا لتكون أساسا في سيتوسول في الخلايا يستريح مترجمة، وثم أنها translocates إلى النواة لتنشيط الجينات ردا على السيتوكينات18. كما STAT3 translocates إلى الميتوكوندريا وينظم دورة TCA و إنتاج ATP19. وفيما يتعلق بالتنظيم أوتوفاجي، ينظم التعريب سوبسيلولار مختلفة من STAT3 أوتوفاجي في مختلف طرق20. على سبيل المثال، STAT3 النووية ترانسكريبتيونالي ينظم الجينات المتعلقة أوتوفاجي ويعمل المغير أوتوفاجي. STAT3 هيولى مؤثرا يحول دون أوتوفاجي بالتفاعل مع إشارات الجزيئات أوتوفاجي. يحول دون STAT3 الميتوكوندريا ويمنع ميتوفاجي بقمع أوتوفاجي الأكسدة المستحث. ولذلك، هذا الأسلوب عزل المقصورة سوبسيلولار أمر حاسم لفهم دور أخرى إشارات الجزيئات، وكذلك ERK1/2.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن أثبت أن يحدث التنشيط ERK1/2 الببتيد بوساطة هومانين في نوعين من خلايا مختلفة، وتعريب سوبسيلولار لتنشيط ERK1/2 يمكن أن تختلف تبعاً للظروف (مثلاً، جرعة الببتيد والنقطة الزمنية، والخلية نوع). وقد ثبت أن هومانين إشارات عن طريق مستقبلات مختلفة اثنين22،23، …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها أليسون/عفر “زمالات ما بعد الدكتوراه” في “برنامج بحوث الشيخوخة” إلى سيك، ومنح جائزة مؤسسة جلين، والمعاهد الوطنية للصحة للكمبيوتر (1P01AG034906، 1R01GM 090311، 1R01ES 020812). تظهر كافة المؤلفين في الفيلم.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referências
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death–apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK–a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
