Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לעורר תאים עם פפטידים מיטוכונדריאלי נגזר ולהעריך את המפל ואת לוקליזציה של פוספו-חלבונים איתות.
Abstract
פפטידים, נגזר מיטוכונדריאלי (MDPs) הם סוג חדש של פפטידים מקודדים על ידי קריאה פתוחה קטנה מסגרות אחרות הגנים הידועים של הגנום מיטוכונדריאלי. MDPs יש מגוון רחב של השפעות ביולוגיות כגון הגנה על הנוירונים מפני אפופטוזיס, שיפור סמנים מטבוליים, הגנה על תאים מכימותרפיה. Humanin היה MDP הראשון להתגלות, פפטיד הכי נחקרות בקרב משפחת MDP. קולטני ממברנה ואת הזרם איתות המסלולים של humanin יש בקפידה מלווה. MDPs נוספים כגון MOTS-c ו- SHLP1-6 התגלו לאחרונה, מנגנוני איתות שעדיין לא להיות הובהר. כאן נתאר שיטת תרבות המבוססת תא כדי לקבוע את הפונקציה של פפטידים אלה. בפרט, מאפשרים תא טכניקות fractionation בשילוב עם סופג המערבי הקביעה כמותית של ההפעלה, טרנסלוקציה של מולקולת איתות חשוב. אמנם יש שיטות אחרות של תא fractionation, המתואר כאן היא שיטה פשוטה וקלה. שיטות אלה ניתן להבהיר עוד יותר את מנגנון הפעולה של פפטידים אלה וסוכנים טיפוליים אחרים.
Introduction
המתעוררים מחקרים מראים כי מיטוכונדריאלי נגזר פפטידים (MDPs) תפקיד חשוב cytoprotection ואת חילוף החומרים1,2,3. הבנת מסלול התמרה חושית אות בנוכחות MDPs נותן לנו תובנה המנגנון שבאמצעותו MDPs לווסת פונקציות שונות. MDP מזוהה הראשון, humanin, הוכח להגדיל חוץ-תאית מוסדר אות קינאז 1/2 (ERK1/2) זרחון באמצעות הקולטן שלו מחייב4,5. עם זאת, השפעת הזרם הפעלה ERK1/2 הוא עדיין כשתפסעו.
המפל ERK1/2 משמש מתווך חיוני במגוון תהליכים תאיים כולל התפשטות, נדידת תאים, חילוף החומרים הסלולר, הישרדות של אפופטוזיס-6,–7,–8. שננהל את כל אלה תהליכים תאיים שונים, פעילות subcellular לוקליזציה של ERK1/2 מוסדרים בחוזקה על ידי phosphatases ולגרדום חלבונים9,10. בנוסף השינוי post-translational, ונעים דינמי של ERK1/2 גם מסדיר את איתות פונקציה, פעילות וספציפיות11,12. ERK1/2 הוא בעיקר מקומי ציטוזול13. קבוצה של חלבונים עיגון, לגרדום לסייע לשמור על ERK1/2 אלמנטים cytoskeletal, על פני שטח של organelles, או כשמאירים הציטופלסמה13. על גירוי, ERK1/2 הוא phosphorylated, הופך בלתי משויך לזהויות חלבונים עגינת שלה, המאפשר רוברטסונית של ERK1/2 כדי מדורים subcellular אחרים, לרבות גרעין, מיטוכונדריה, גולג’י, lysosomes14, 15 , 16.
למרות humanin ידוע כדי להפעיל את איתות ERK1/2, הפעלת ERK1/2 נצפית רק ב lysates התא סך הכל. כפי שתואר לעיל, מאז לוקליזציה subcellular ERK1/2 ממלא תפקיד מכריע השפעתו במורד הזרם, הניתוח של הן ההתאמה subcellular ואת רמות סך של phosphorylated ERK1/2 יש צורך לספק הבנה מקיפה של הפעלת ERK1/2 humanin-induced והפעלה של מטרות במורד הזרם.
כדי להבין את organelles המטרה של הפעלת ERK1/2, בוצעה fractionation subcellular ואחריו סופג המערבי ERK1 phosphorylated/2. בשיטה זו ניתן ליישם בקלות כפי הוא מנצל ריאגנטים וציוד מעבדה סטנדרטיים. התאים subcellular מבודדים הן טוהר גבוהה, ומאפשר את התוצאות יפורשו אבר המין הגברי. Immunostaining של ERK1/2 עשויה לייצר תוצאות דומות. עם זאת, תאים subcellular מסוימים קשים יחסית להמחיש ויידרש קיבוע מיוחד ושיטות permeabilization. ERK1/2 רמות משתנות של תאים subcellular, וריאציה זו עלולה לגרום אותות שלילי כוזב חיובי ו- false כאשר מסתכלים על כל התא lysates. לכן, immunoblot באמצעות תאים מבודדים subcellular נותן לנו הבנה טובה יותר של לוקליזציה ERK1/2.
צדדיות של השיטה מאפשרת שינויים בפרוטוקול כדי לחקור את ההשפעות של ממריצים אחרים כולל טרנסלוקציה של מולקולות איתות אחרות כגון STAT3 או MDPs אחרים. לאחרונה התגלה קטן humanin דמויי פפטידים (SHLPs) מקודדים מאזור rRNA 16 שבו humanin מקודד, יש להם מאפיינים דומים אך ברורים בהשוואה ל ח נ17. לדוגמה, SHLP2 ו- SHLP3 להפעיל ERK1/2 לאחר 8 שעות למרות humanin מפעילה ERK1/2 תוך 5 דק Examining subcellular לוקליזציה של ERK1/2 בתגובה פפטידים שונים ייתן לנו הבנה טובה יותר של הביולוגיה של פפטידים אלה. מתעוררים הראיות הראה לוקליזציה subcellular של מולקולות איתות ממלא תפקיד מכריע שלהם אפקטים במורד הזרם. למשל, STAT3 באופן מסורתי ידוע להיות מותאם בעיקר ציטוזול בתאים resting ולאחר מכן זה translocates לתוך הגרעין להפעלת גנים בתגובה ציטוקינים18. STAT3 גם translocates את המיטוכונדריה, מסדיר את המחזור TCA ו- ATP ייצור19. מנשר autophagy, לוקליזציה subcellular שונים של STAT3 ממיקרו autophagy דרכים שונות20. לדוגמה, STAT3 גרעיני transcriptionally מסדיר גנים הקשורים autophagy, משמש אפנן autophagy. Cytoplasmic STAT3 מעכב צורונים autophagy על ידי אינטראקציה עם autophagy מולקולות איתות. STAT3 מיטוכונדריאלי מעכב ומונע mitophagy על-ידי דיכוי autophagy סטרס חמצוני המושרה. לכן, בשיטה זו בידוד תא subcellular חיוני להבנת תפקידם של אחרים איתות מולקולות כמו גם ERK1/2.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, הפגנו כי humanin בתיווך פפטיד ERK1/2 הפעלת מתרחשת בשני סוגי תאים שונים, לוקליזציה subcellular של מופעל ERK1/2 יכולה להיות שונה בהתאם לתנאים (למשל, מנה של פפטיד, נקודת זמן תא סוג). הוכח כי humanin אותות דרך שני קולטנים שונים22,23, אשר עשוי להסביר את ההבדלים איתות בין הקוו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הבתר אליסון/עפר בתוכנית לחקר הזדקנות כדי SJK, פרס גלן וחדר NIH מעניקה למחשב (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). כל המחברים מופיע בסרט.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referências
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death–apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK–a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
