Mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड उपचार पर ERK सक्रियण के लिए उपसेलुलर अंश
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित और संकेतन झरना और phospho-प्रोटीन के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए.
Abstract
Mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (MDPs) Mitochondrial जीनोम के अन्य ज्ञात जीन के भीतर छोटे खुले पढ़ने फ्रेम द्वारा इनकोडिंग रहे हैं कि पेप्टाइड्स के एक नए वर्ग के हैं. MDPs इस तरह के apoptosis से न्यूरॉन्स की रक्षा के रूप में जैविक प्रभाव की एक विस्तृत विविधता है, चयापचय मार्कर में सुधार, और कीमोथेरेपी से कोशिकाओं की रक्षा. Humanin पहले एचडीपी की खोज की थी और एचडीपी परिवार के बीच सबसे अधिक अध्ययन पेप्टाइड है । झिल्ली रिसेप्टर्स और बहाव humanin के मार्ग संकेत ध्यान से विशेषता है । अतिरिक्त MDPs जैसे MOTS-सी और SHLP1-६ का हाल ही में पता चला है और सिगनल तंत्र का अभी तक आविर्भाव हुआ है. यहाँ हम एक सेल संस्कृति आधारित विधि का वर्णन करने के लिए इन पेप्टाइड्स के समारोह का निर्धारण. विशेष रूप से, पश्चिमी सोख्ता के साथ संयोजन में सेल भिन्नीकरण तकनीक सक्रियण और महत्वपूर्ण संकेतन अणु के translocation के मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं । जबकि वहां कोशिका अंश के अंय तरीके हैं, एक यहां वर्णित एक आसान और सरल तरीका है । इन विधियों का उपयोग इन पेप्टाइड्स और अन्य चिकित्सीय एजेंटों की कार्रवाई के तंत्र को आगे स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है ।
Introduction
उभरते अध्ययनों से पता चलता है कि mitochondrial-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (MDPs) cytoprotection और चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1,2,3. MDPs की उपस्थिति में संकेत transduction मार्ग को समझना हमें तंत्र में अंतर्दृष्टि देता है जिसके द्वारा MDPs विभिंन कार्यों को मिलाना । पहली पहचान एचडीपी, humanin, extracellular संकेत को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है-विनियमित कळेनासे 1/2 (ERK1/2) इसके रिसेप्टर बाइंडिंग4,5के माध्यम से फास्फारिलीकरण. हालांकि, ERK1/2 सक्रियण के बहाव के प्रभाव अभी भी पता लगाया है ।
ERK1/2 झरना प्रसार, सेल प्रवास, सेलुलर चयापचय, अस्तित्व, और apoptosis6,7,8सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में एक आवश्यक मध्यस्थ के रूप में कार्य करता है । इन सभी अलग सेलुलर प्रक्रियाओं आर्केस्ट्रा, ERK1/2 के गतिविधि और सेलुलर स्थानीयकरण कसकर phosphatases और पाड़ प्रोटीन9,10द्वारा विनियमित रहे हैं । अनुवाद के बाद संशोधन के अलावा, गतिशील गढ़शंकर के ERK1/2 भी अपने संकेतन समारोह, गतिविधि, और विशिष्टता11,12को नियंत्रित करता है । ERK1/2 cytosol13में मुख्य रूप से स्थानीयकृत है । एंकरिंग और पाड़ प्रोटीन का एक सेट cytoskeletal तत्वों में ERK1/2 बनाए रखने में मदद, organelles की सतह पर, या कोशिका13में फैलाना । उत्तेजना पर, ERK1/2 phosphorylated है और अपने लंगर प्रोटीन से असंबद्ध हो जाता है, ERK1/2 के नाभिक, mitochondria, Golgi, और lysosomes सहित अंय उपसेलुलर डिब्बों को translocation की अनुमति14, 15 , 16.
हालांकि humanin ERK1/2 संकेतन मार्ग सक्रिय करने के लिए जाना जाता है, ERK1/2 के सक्रियण केवल कुल सेल lysates में मनाया जाता है । जैसा कि पहले वर्णित है, के बाद से ERK1/2 उपसेलुलर स्थानीयकरण इसके बहाव प्रभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, दोनों के उपसेलुलर स्थानीयकरण और phosphorylated ERK1/2 के कुल स्तर का विश्लेषण एक व्यापक समझ प्रदान करने के लिए आवश्यक है humanin-प्रेरित ERK1/2 सक्रियण और अनुप्रवाह लक्ष्य के सक्रियकरण ।
सक्रिय ERK1/2 के लक्ष्य organelles को समझने के लिए, उपसेलुलर आंशिक phosphorylated ERK1/2 के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया गया था । यह विधि आसानी से लागू किया जा सकता है के रूप में यह मानक प्रयोगशाला उपकरण और रिएजेंट का इस्तेमाल । पृथक उपसेलुलर डिब्बों उच्च शुद्धता के हैं, की अनुमति परिणाम स्पष्ट रूप से व्याख्या की है । ERK1/2 के Immunostaining समान परिणाम उत्पंन कर सकते हैं । हालांकि, कुछ उपसेलुलर डिब्बों को कल्पना और विशेष निर्धारण और permeabilization तरीकों की आवश्यकता के लिए अपेक्षाकृत कठिन हैं । ERK1/2 स्तर उपसेलुलर डिब्बों में बदलती हैं, और इस भिंनता झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक संकेतों के कारण जब पूरे सेल lysates देख सकता है । इसलिए, एक immunoblot पृथक उपसेलुलर डिब्बों का उपयोग कर हमें ERK1/2 स्थानीयकरण की एक बेहतर समझ देता है ।
इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा को अंय MDPs या STAT3 जैसे अंय संकेत अणुओं के translocation सहित अंय उत्तेजक के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल के संशोधनों को सक्षम बनाता है । हाल ही में छोटे humanin की खोज की तरह पेप्टाइड्स (SHLPs) 16S rRNA क्षेत्र जहां humanin इनकोडिंग है से इनकोडिंग रहे हैं, और वे इसी तरह लेकिन अलग गुण है हेमवती17की तुलना में । उदाहरण के लिए, SHLP2 और SHLP3 सक्रिय ERK1/2 के बाद 8 ज हालांकि humanin 5 मिनट के भीतर ERK1/2 के ERK1/अलग पेप्टाइड के उत्तर में हमें इन पेप्टाइड्स के जीव विज्ञान के एक बेहतर समझ दे देंगे. उभरते सबूत से पता चला है कि संकेत अणुओं के सेलुलर स्थानीयकरण उनके बहाव के प्रभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, STAT3 परंपरागत रूप से कोशिकाओं को आराम में cytosol में स्थानीयकृत जाना जाता है, और फिर यह नाभिक में translocates के जवाब में जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए साइटोकिंस18. STAT3 ने टीसीए चक्र और एटीपी प्रोडक्शन19को mitochondria और विनियमित करने का भी translocates । autophagy विनियमन के बारे में, STAT3 के विभिन्न उपसेलुलर स्थानीयकरण विभिन्न तरीकों से20में autophagy संग्राहक. उदाहरण के लिए, नाभिकीय STAT3 transcriptionally autophagy-संबंधी जीन को नियंत्रित करता है और एक autophagy संग्राहक के रूप में कार्य करती है । Cytoplasmic STAT3 constitutively autophagy संकेत अणुओं के साथ बातचीत से autophagy रोकता है । Mitochondrial STAT3 रोकता है और oxidative तनाव प्रेरित autophagy दबा द्वारा mitophagy रोकता है । इसलिए, इस उपसेलुलर डिब्बा अलगाव विधि अंय संकेत अणुओं की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और साथ ही ERK1/
Protocol
1. कोशिकाओं को पेप्टाइड उपचार प्लेट २,०००,००० श-SY5Y या HEK293 कोशिकाओं (2 x 10 6 ) एक 10 सेमी डिश में और उन्हें 2 दिनों के लिए विकसित (वैकल्पिक) अगले दिन, कोशिकाओं को सीरम मुक्त Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) ?…
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम प्रदर्शन किया कि humanin पेप्टाइड-मध्यस्थता ERK1/2 सक्रियण दो भिन्न प्रकार के कक्ष में होता है, और सक्रिय ERK1/2 के उपसेलुलर स्थानीयकरण शर्तों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (जैसे, खुराक पेप्टाइड, समय बिंद?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम उंर बढ़ने अनुसंधान कार्यक्रम में SJK को एक एलिसन/अफर Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, और एक ग्लेन फाउंडेशन पुरस्कार और पीसी के लिए NIH अनुदान (1P01AG034906, 1R01GM ०९०३११, 1R01ES ०२०८१२) । सभी लेखक फिल्म में दिखाई देते हैं ।
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referências
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