Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale
Summary
Ce protocole décrit comment stimuler les cellules avec des peptides dérivés mitochondriale et évaluer la signalisation cascade et la localisation des phospho-protéines.
Abstract
Peptides dérivés mitochondrial (AMD) sont une nouvelle classe de peptides qui sont codées par des cadres de lecture ouvert petit au sein d’autres gènes connus du génome mitochondrial. Les AMD ont une grande variété d’effets biologiques tels que la protection des neurones contre l’apoptose, l’amélioration des marqueurs métaboliques et protégeant les cellules de la chimiothérapie. Humanin a été le premier MDP à découvrir et est la plus étudiée peptide parmi la famille des MDP. Les récepteurs membranaires et les voies de signalisation en aval de humanin ont été soigneusement caractérisés. Les AMD supplémentaires telles que des MOTS-c et SHLP1-6 ont été découvertes plus récemment et les mécanismes de signalisation n’ont pas encore à élucider. Nous décrivons ici une méthode fondés sur la culture de cellules pour déterminer la fonction de ces peptides. En particulier, les techniques de fractionnement cellulaire en combinaison avec western blot permettent la détermination quantitative de l’activation et la translocation de la molécule de signalisation importante. Bien qu’il existe d’autres méthodes de fractionnement cellulaire, celle décrite ici est une méthode simple et directe. Ces méthodes peuvent être utilisées pour élucider plus loin le mécanisme d’action de ces peptides et d’autres agents thérapeutiques.
Introduction
Nouvelles études montrent que les peptides dérivés mitochondriale (AMD) jouent des rôles importants de cytoprotection et métabolisme1,2,3. Comprendre la voie de transduction de signal en présence d’AMD nous donne un aperçu du mécanisme par lequel les AMD modulent diverses fonctions. Le premier MDP identifié, humanin, a été montré pour augmenter la kinase de signal-réglée extracellulaire 1/2 (ERK1/2) phosphorylation par l’intermédiaire de son récepteur liaison4,5. Cependant, l’effet en aval de l’activation de ERK1/2 est toujours sous-explorée.
La cascade de ERK1/2 sert de médiateur essentiel dans une variété de processus cellulaires comme la prolifération, la migration cellulaire, métabolisme cellulaire, la survie et l’apoptose6,7,8. Pour orchestrer tous ces processus cellulaires distincts, l’activité et la localisation subcellulaire de ERK1/2 sont étroitement contrôlées par des phosphatases et échafaudage protéines9,10. En plus des modifications post-traductionnelles, la dynamique de la navette de ERK1/2 réglemente également sa signalisation fonction, activité et spécificité11,12. ERK1/2 est principalement localisée dans le cytosol13. Un ensemble de protéines d’ancrage et échafaudage aident à retenir ERK1/2 dans les éléments du cytosquelette, sur la surface des organites ou diffus dans le cytoplasme13. Lors de la stimulation, ERK1/2 est phosphorylé et devient dissocié de ses protéines d’ancrage, ce qui permet la translocation de ERK1/2 aux autres compartiments subcellulaires, y compris le noyau, mitochondries, Golgi et lysosomes14, 15 , 16.
Humanin est connu pour activer la ERK1/2 voie de signalisation, l’activation de ERK1/2 est observée seulement dans les lysats cellulaires totales. Comme décrit auparavant, car la localisation subcellulaire de ERK1/2 joue un rôle crucial dans son effet en aval, l’analyse de la localisation subcellulaire et les concentrations totales de phosphorylés ERK1/2 est nécessaire pour fournir une compréhension globale d’activation de ERK1/2 induite par le humanin et l’activation des cibles en aval.
Pour comprendre les organites cibles de ERK1/2 activé, fractionnement subcellulaire suivi par western blot pour phosphorylés ERK1/2 a été réalisé. Cette méthode peut être facilement mis en œuvre comme il utilise des réactifs et matériel de laboratoire standard. Les compartiments subcellulaires isolés sont d’une grande pureté, permettant que les résultats être interprété de façon directe. Immunomarquage de ERK1/2 peut produire des résultats similaires. Toutefois, certains compartiments subcellulaires sont relativement difficiles à visualiser et exigent des méthodes spéciales de fixation et perméabilisation. ERK1/2 niveaux varient dans les compartiments subcellulaires, et cette variation pourrait provoquer de faux positifs et fausses négatifs signaux quand on regarde les lysats de cellules entières. Par conséquent, un immunoblot utilisant des compartiments subcellulaires isolés nous donne une meilleure compréhension de la localisation de ERK1/2.
La polyvalence de la méthode permet aux modifications du protocole à examiner les effets d’autres stimulants, y compris les autres AMD ou translocation d’autres molécules de signalisation tels que STAT3. Récemment découverts petits humanin-like peptides (SHLPs) sont codés de la région d’ARNr 16 s où humanin est codé, et elles ont des propriétés similaires mais distinctes contre HN17. Par exemple, SHLP2 et SHLP3 activent ERK1/2 après que 8 h bien que humanin active ERK1/2 dans 5 min. examen localisation subcellulaire de ERK1/2 en réponse à différents peptides nous donnera une meilleure compréhension de la biologie de ces peptides. Des preuves nouvelles, ont montré que la localisation subcellulaire de molécules de signalisation joue un rôle crucial dans leurs effets en aval. Par exemple, STAT3 est traditionnellement connu pour être localisés principalement dans le cytosol des cellules au repos, et ensuite il translocation dans le noyau pour activer l’expression des gènes en réponse à des cytokines18. Stat3 également translocation aux mitochondries et régule le cycle de Krebs et ATP production19. Concernant le règlement de l’autophagie, différente localisation subcellulaire de STAT3 module autophagie dans diverses manières20. Par exemple, nucléaire STAT3 transcriptionnellement régule les gènes liés à l’autophagie et agit comme un modulateur de l’autophagie. Cytoplasmique STAT3 inhibe constitutivement autophagie en interagissant avec autophagie molécules de signalisation. Mitochondrial STAT3 inhibe et empêche mitophagy en supprimant le stress oxydatif induit par autophagie. Par conséquent, cette méthode d’isolation compartiment subcellulaire est cruciale pour comprendre le rôle des autres molécules de signalisation ainsi que les ERK1/2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons démontré que humanin induite par le peptide ERK1/2 activation se produit dans deux types de cellules différentes, et la localisation subcellulaire d’activées ERK1/2 peut être différente selon les conditions (p. ex., dose de peptide, point dans le temps et cellule type). Il a été démontré que humanin signaux par l’intermédiaire de deux récepteurs différents22,23, qui peut expliquer les différences de signalisation entre l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de Ellison/AFAR in Aging Research Program à SJK, et un prix de la Fondation Glenn et le NIH accorde aux PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tous les auteurs apparaissent dans le film.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referências
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