Subzellulären Fraktionierung für ERK-Aktivierung bei der mitochondrialen abgeleitet Peptid-Behandlung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen mit mitochondrialen-abgeleitete Peptide stimulieren und die Signalisierung Kaskade und Lokalisierung von Phospho-Proteine zu beurteilen.
Abstract
Mitochondriale-abgeleitete Peptide (MDPs) sind eine neue Klasse von Peptiden, die durch kleine offene Lesung Rahmen in anderen bekannten Genen des mitochondrialen Genoms kodiert sind. MDPs haben eine Vielzahl von biologischen Wirkungen wie Neuronen vor Apoptose zu schützen, Verbesserung der Stoffwechselmarker und schützt Zellen vor Chemotherapie. Humanin war der erste MDP, entdeckt zu werden und ist die am meisten untersuchte Peptid unter der MDP-Familie. Die Membranrezeptoren und nachgeschaltete Signalwege der Humanin wurden sorgfältig charakterisiert. Zusätzliche MDPs wie MOTS-c und SHLP1-6 haben vor kurzem entdeckt und die Signalisierung Mechanismen müssen noch geklärt werden. Hier beschreiben wir eine Zelle Kultur, die Methode, um die Funktion dieser Peptide bestimmen. Insbesondere erlauben Zelle Fraktionierung Techniken in Kombination mit westlichen beflecken für die quantitative Bestimmung der Aktivierung und Translokation von wichtiges Signalmolekül. Zwar gibt es andere Methoden der Zelle Fraktionierung, ist wie hier beschrieben eine einfache und unkomplizierte Methode. Diese Methoden können verwendet werden, den Wirkmechanismus dieser Peptide und andere Therapeutika weiter aufzuklären.
Introduction
Neue Studien zeigen, dass Mitochondrien-abgeleitete Peptide (MDPs) in Cytoprotection und Stoffwechsel1,2,3eine wichtige Rolle spielen. Verständnis der Signalweg Transduktion in Anwesenheit von MDPs gibt uns Einblick in den Mechanismus, durch den MDPs verschiedene Funktionen modulieren. Die erste identifizierte MDP, Humanin, wurde gezeigt, dass extrazelluläre Signal-regulierte Kinase 1/2 (ERK1/2) erhöhen Phosphorylierung durch seinen Rezeptor binden4,5. Die nachgeschaltete Wirkung von ERK1/2 Aktivierung ist jedoch immer noch unentdecktes.
Die Kaskade ERK1/2 dient als ein wesentlicher Vermittler in einer Vielzahl von zellulären Prozessen einschließlich Proliferation, Zellmigration, Zellstoffwechsel, überleben und Apoptose6,7,8. Um alle zu orchestrieren sind diese unterschiedliche zelluläre Prozesse, die Aktivität und subzelluläre Lokalisation der ERK1/2 durch Phosphatasen und Gerüst Proteine9,10streng reguliert. Neben Post-translationale Modifikation regelt dynamische pendelt von ERK1/2 auch die Signalisierung Funktion, Bewegung und Spezifität11,–12. ERK1/2 ist in erster Linie in der Zellflüssigkeit13lokalisiert. Eine Reihe von Ankern und Gerüst Proteine helfen ERK1/2 im Zellskelett Elemente auf der Oberfläche der Organellen oder diffuse im Zytoplasma13beibehalten. Nach Stimulation ERK1/2 ist phosphoryliert und wird aus seiner Verankerung Proteine dissoziiert, so dass die Translokation von ERK1/2 zu anderen subzelluläre Kompartimente, einschließlich der Zellkern, Mitochondrien, Golgi und Lysosomen14, 15 , 16.
Humanin ist zwar bekannt, die ERK1/2 Signalweg aktivieren, wird die Aktivierung von ERK1/2 nur in der Ergebniszelle Lysates beobachtet. Wie zuvor beschrieben, da ERK1/2 subzelluläre Lokalisation eine entscheidende Rolle für die nachgeschaltete Wirkung, die Analyse der subzellulären Lokalisierung und der gesamten spielt ist phosphorylierten ERK1/2 notwendig, ein umfassendes Verständnis der Humanin-induzierten ERK1/2 Aktivierung und die Aktivierung der nachgeschalteten Ziele.
Um das Ziel Organellen der aktivierten ERK1/2 zu verstehen, wurde subzellulären Fraktionierung gefolgt von westlichen beflecken für phosphorylierten ERK1/2 durchgeführt. Diese Methode kann leicht implementiert werden, da es standard Laborgeräten und Reagenzien verwendet. Die isolierten subzelluläre Kompartimente sind von hoher Reinheit, sodass die Ergebnisse unkompliziert auszulegen. Immunostaining ERK1/2 kann zu ähnliche Ergebnissen führen. Allerdings sind bestimmte subzelluläre Kompartimente relativ schwer zu visualisieren und erfordern besondere Fixierung und Permeabilisierung Methoden. ERK1/2 Ebenen subzelluläre Kompartimente sind unterschiedlich, und diese Variante könnte dazu führen, dass falsch positive und falsch negative Signale bei der Betrachtung der gesamten Zelle Lysates. Daher gibt ein Immunoblot mit isolierten subzelluläre Kompartimente uns ein besseres Verständnis der ERK1/2 Lokalisierung.
Die Vielseitigkeit der Methode ermöglicht Änderungen des Protokolls zum anderen Stimulanzien, einschließlich andere MDPs oder Translokation der andere Signalmoleküle wie STAT3 auswirkt. Vor kurzem sind entdeckten kleinen Humanin-wie Peptide (SHLPs) von 16 s rRNA Region codiert, wo Humanin codiert, und sie haben ähnliche aber unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu HN17. Z. B. aktivieren SHLP2 und SHLP3 ERK1/2 nach 8 h obwohl Humanin ERK1/2 innerhalb von 5 min. Prüfungs-subzelluläre Lokalisation der ERK1/2 als Reaktion auf unterschiedliche Peptiden aktiviert uns ein besseres Verständnis für die Biologie dieser Peptide geben wird. Anzeichen dafür zeigte, dass die subzelluläre Lokalisation der Signalmoleküle in deren nachgelagerten Auswirkungen eine entscheidende Rolle spielt. Zum Beispiel STAT3 ist traditionell bekannt, vor allem in der Zellflüssigkeit in ruhende Zellen lokalisiert werden, und dann translocates es in den Zellkern, Genexpression in Reaktion auf Zytokine18zu aktivieren. STAT3 auch translocates zu Mitochondrien und regelt die TCA-Zyklus und ATP Produktion19. Zur Regelung der Autophagie moduliert verschiedene subzelluläre Lokalisation des STAT3 Autophagie in verschiedenen Weisen20. Z. B. nuklearen STAT3 transcriptionally Autophagie-Genen reguliert und fungiert als ein Autophagie-Modulator. Zytoplasmatischen STAT3 hemmt konstitutiv Autophagie durch Interaktion mit Autophagie Signalmoleküle. Mitochondriale STAT3 hemmt und verhindert Mitophagy durch oxidativen Stress induzierten Autophagie zu unterdrücken. Daher ist diese subzelluläre Fach Isolationsmethode entscheidend für das Verständnis der Rolle der anderen Signalisierung Moleküle sowie ERK1/2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir bewiesen, dass Humanin Peptid-vermittelten ERK1/2 Aktivierung in zwei verschiedenen Zelltypen tritt und die subzelluläre Lokalisation des aktivierten ERK1/2, je nach Bedingungen (z.B., Portion Peptid, Zeitpunkt und Zelle abweichen kann Typ). Es hat sich gezeigt, dass Humanin Signale durch zwei verschiedene Rezeptoren22,23, die die Unterschiede bei der Signalisierung zwischen den beiden Zelllinien sowie die Forderung nach verschiedenen Dos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship in Aging Research Program, SJK und ein Glenn Foundation Award und NIH vergibt an PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alle Autoren erscheinen im Film.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referências
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