ミトコンドリア由来ペプチド治療時に ERK の活性化のための細胞レベル下の分別
Summary
このプロトコルでは、ミトコンドリア由来ペプチドと細胞を刺激し、シグナル伝達カスケードとリン蛋白質の局在化を評価する方法について説明します。
Abstract
ミトコンドリア由来ペプチド (MDPs) は、ミトコンドリアのゲノムの他の知られている遺伝子の中で小型の開いたリーディング ・ フレームによってエンコードされているペプチドの新しいクラスです。MDPs は、アポトーシスからニューロンを保護する、代謝マーカーの改善、化学療法から細胞を保護するなどの生物学的効果のさまざまながあります。Humanin 発見される最初の民主党、民主党の家族の間で最も研究のペプチド。膜受容体と humanin の下流のシグナル伝達経路を慎重に特徴づけられています。MOTS c など SHLP1 6 追加 MDPs を最近発見されているし、シグナリング メカニズムは解明することいません。ここでこれらのペプチドの機能を決定する細胞文化ベース手法について述べる。特に、西部のしみとの組み合わせでのセル分別の技術の活性化の定量及び重要なシグナル伝達分子の転流を可能にします。セル分別の他の方法がありますが、ここで説明は簡単でわかりやすい方法です。さらにこれらのペプチドとその他の治療薬の作用メカニズムを解明するため、これらのメソッドを使用できます。
Introduction
新興の研究は、ミトコンドリア由来ペプチド (MDPs) がより, および代謝の1,2,3で重要な役割を果たすことを示しています。MDPs の存在下での信号伝達経路を理解する MDPs は様々 な機能を調節するメカニズムへの洞察力をくれます。最初の識別された民主党、humanin、細胞外シグナル調節キナーゼ 1/2 (ERK1/2) を増加する示されているバインド4,5その受容体をリン酸化します。しかし、ERK1/2 活性化の下流の効果はまだエコイノベーションです。
ERK1/2 カスケードは、さまざまな増殖、細胞遊走、細胞代謝、生存、およびアポトーシス6,7,8を含む細胞プロセスで重要な仲介者として機能します。すべてを調整するには、これらの明瞭な細胞プロセス、アクティビティ、ERK1/2 の細胞内局しっかりとホスファターゼと足場蛋白質9,10によって規制されました。翻訳後修飾に加えて ERK1/2 の動的往復もそのシグナル伝達関数、アクティビティ、および特異性11,12を調節します。ERK1/2 は主に細胞質13でローカライズされます。一連のアンカーと足場蛋白質の細胞小器官の表面や細胞質13で拡散の骨格要素の ERK1/2 を維持するため。刺激、ERK1/2 リン酸化、ERK1/2 核、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム14,を含む他の細胞内コンパートメントへの転流をできるようにそのアンカリングのタンパク質から解離になります。15,16。
Humanin ERK1/2 シグナル伝達経路をアクティブに知られているが、合計のセル lysates においてのみ ERK1/2 の活性化です。リン酸化 ERK1/2 は包括的な理解を提供するために必要な ERK1/2 内局その波及効果, 両方の細胞内局在の解析とのレベルの合計の重大な役割を果たしているので前述のようhumanin ERK1/2 活性化の下流ターゲットのアクティブ化。
アクティブ ERK1/2 ターゲット細胞内小器官を理解するには、リン酸化 ERK1/2 ウェスタンブロッティング続いて細胞レベル下の分別を行った。このメソッドは、これは標準的な実験装置および試薬を活用して簡単に実装することができます。孤立した細胞内コンパートメントは、高純度、結果を素直に解釈することができます。ERK1 染色/2 似たような結果が生じる。ただし、特定の細胞内コンパートメントは視覚化する、特別な固定・透過方法を必要とする比較的難しいです。ERK1/2 レベル細胞レベル下コンパートメントによって異なり、全体のセル lysates を見ている時、この変化が原因で、偽陽性と偽否定的な信号。したがって、ERK1/2 ローカリゼーションの理解も、イムノブロット分離細胞レベル下コンパートメントを使用してくれます。
メソッドの汎用性により、他 MDPs STAT3 など他のシグナリング分子の転流を含む他の興奮剤の効果を調査するためのプロトコルの変更です。最近発見された小さな humanin のようなペプチド (SHLPs) は 16S rRNA 地域どこ humanin がエンコードされていると HN17と比較して似ていますが、異なるプロパティがあるからエンコードされます。たとえば、SHLP2 と SHLP3 は 8 h humanin 内局在 ERK1/2 の異なるペプチドへの応答で審査 5 分以内 ERK1/2 がアクティブになりますを与える私たちこれらのペプチドの生物学のよりよい理解後、ERK1/2 をアクティブにします。出現の証拠は、シグナル分子の細胞内の局在が彼らの下流の効果の重要な役割を果たしていることを示した。例えば、STAT3 が伝統的静止期細胞の細胞質でローカライズされる主に知られているが、それがサイトカイン18への応答における遺伝子発現をアクティブにする核に移行します。STAT3 はまたミトコンドリアに移行し、TCA サイクル、ATP 生産19を調節します。オートファジー規制に関する STAT3 の異なる細胞内局は、さまざまな方法20でオートファジーを変調します。たとえば、核 STAT3 は転写オートファジー関連遺伝子の発現制御し、オートファジーの変調器として機能します。細胞質の STAT3 恒常オートファジー シグナル分子との相互作用によってオートファジーを抑制します。ミトコンドリア STAT3 阻害し、酸化ストレス誘導されるオートファジーを抑制することによって mitophagy を防ぐことができます。したがって、この細胞レベル下コンパートメントの分離方法は他シグナリング分子、ERK1/2 の役割を理解するために重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、我々 は実証 humanin ペプチドを介した ERK1/2 活性化は、2 つの異なる細胞型と活性 ERK1/2 の細胞内局は条件 (例えばペプチド、時点、およびセルの線量によって異なることがあります。型)。それはその humanin を示されている 2 つの異なる受容器22,23, humanin の異なる用量の要件と同様に、2 つの細胞間シグナル伝達に違いを説明するか?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、SJK、高齢化研究プログラムでエリソン/遠く員によって支えられた、グレン財団賞と NIH の PC への許可 (1P01AG034906、1R01GM 1R01ES 090311 020812)。映画の中にすべての著者が表示されます。
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referências
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death–apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK–a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
