Subcellular fraksjoneres for ERK aktivisering på mitokondrie-avledet peptid behandling
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan å stimulere celler med mitokondrie-avledet peptider og vurdere signalnettverk cascade og lokalisering av phospho-proteiner.
Abstract
Mitokondrielt-avledet peptider (MDPs) er en ny klasse av peptider som kodes ved små åpent lesing rammer i andre kjente gener i mitokondrie genomet. MDPs har et bredt spekter av biologiske effekter som beskytter neurons fra apoptose, forbedre metabolske markører og beskytte celler fra kjemoterapi. Humanin var den første MDP å bli oppdaget og er den mest studerte peptid blant MDP familie. Av membran reseptorer og nedstrøms signalveier av humanin har blitt nøye preget. Flere MDPs som MOTS-c og SHLP1-6 har oppdaget nylig og signalnettverk mekanismer har ennå å bli belyst. Her beskriver vi en celle kultur basert metode for å bestemme funksjonen av disse peptider. Spesielt tillate celle fraksjoneres teknikker i kombinasjon med vestlige blotting kvantitative fastsettelse av aktivisering og translokasjon av viktig signalnettverk molekyl. Det finnes andre metoder for celle fraksjoneres, er beskrevet her en enkel og grei metode. Disse metodene kan brukes til å belyse ytterligere virkningsmekanismen av disse peptider og andre terapeutiske agenter.
Introduction
Nye studier viser at mitokondrie-avledet peptider (MDPs) spille en viktig rolle i cytoprotection og metabolisme1,2,3. Forstå signal signaltransduksjon veien i nærvær av MDPs gir oss innsikt i mekanismen som MDPs modulerer ulike funksjoner. Den første identifiserte MDP, humanin, har vist seg å øke ekstracellulære signal regulert kinase 1/2 (ERK1/2) fosforylering gjennom reseptor bindende4,5. Nedstrøms virkningen av ERK1/2 aktivisering er imidlertid fortsatt underexplored.
ERK1/2 kaskade fungerer som en viktig megler i en rekke cellulære prosesser inkludert spredning, celle migrasjon, cellenes stoffskifte, overlevelse og apoptose6,7,8. For å organisere alle reguleres disse ulike cellulære prosesser, aktivitet og subcellular lokalisering av ERK1/2 tett av phosphatases og stillaset proteiner9,10. I tillegg til post-translasjonell modifikasjon regulerer det dynamiske skytteltrafikk av ERK1/2 også sin signalnettverk funksjon, aktivitet og spesifisitet11,12. ERK1/2 er hovedsakelig lokalisert i stoffer13. Et sett med forankring og stillaset proteiner hjelpe beholde ERK1/2 i cellen cytoskjelett elementer, på overflaten av organeller eller diffust i cytoplasma13. Ved stimulering, ERK1/2 er fosforylert og blir skilt fra sin forankring proteiner, slik at translokasjon av ERK1/2 til andre subcellular rom, inkludert kjernen, mitokondrier, Golgi og lysosomer14, 15 , 16.
Selv om humanin er kjent for å aktivere den ERK1/2 signalveien, er aktivering av ERK1/2 bare observert i totalt-cellen lysates. Som beskrevet tidligere, siden ERK1/2 subcellular lokalisering spiller en avgjørende rolle i sin nedstrøms effekt, analyse av både den subcellular lokaliseringen og totale nivåer av er fosforylert ERK1/2 nødvendig for å gi en omfattende forståelse humanin-indusert ERK1/2 aktivisering og aktivering av nedstrøms mål.
For å forstå målet organeller aktivert ERK1/2, ble subcellular fraksjoneres etterfulgt av vestlige blotting fosforylert ERK1/2 utført. Denne metoden kan implementeres enkelt som det benytter standard laboratorieutstyr og reagenser. Isolerte subcellular seksjonene er av høy renhet, slik at resultatene tolkes oversiktlig. Immunostai-av ERK1/2 kan gi lignende resultater. Men er visse subcellular rom relativt vanskelig å visualisere og krever spesielle fiksering og permeabilization metoder. ERK1/2 nivåer varierer i subcellular rom, og denne varianten kan føre falske positive og falske negative signaler når du ser på hele cellen lysates. Derfor gir en immunoblot med isolert subcellular rom oss en bedre forståelse av ERK1/2 lokalisering.
Allsidigheten til metoden gjør endringer av protokollen for å undersøke effekten av andre sentralstimulerende stoffer inkludert andre MDPs eller translokasjon av andre signalnettverk molekyler som STAT3. Nylig er oppdaget små humanin-lignende peptider (SHLPs) kodet fra 16S rRNA regionen der humanin er kodet, og de har lignende, men forskjellige egenskaper sammenlignet HN17. For eksempel aktivere SHLP2 og SHLP3 ERK1/2 etter 8 timer selv om humanin aktiverer ERK1/2 i 5 min. undersøke subcellular lokalisering av ERK1/2 forskjellige peptider som svar vil gi oss en bedre forståelse av biologi av disse peptider. Nye bevis viste at den subcellular lokaliseringen signalnettverk molekyler spiller en avgjørende rolle i deres nedstrøms effekter. For eksempel STAT3 tradisjonelt er kjent for å være hovedsakelig lokalisert i stoffer i hvile celler, og deretter det translocates til kjernen å aktivere genuttrykk svar cytokiner18. STAT3 også translocates til mitokondrier og regulerer TCA syklus og ATP produksjonen19. Om autophagy regulering modulerer forskjellige subcellular lokalisering av STAT3 autophagy i ulike måter20. For eksempel kjernefysiske STAT3 transcriptionally regulerer autophagy-relaterte gener og fungerer som en autophagy-modulator. Cytoplasmatiske STAT3 hemmer constitutively autophagy av samspill med autophagy signalnettverk molekyler. Mitokondrielt STAT3 hemmer og hindrer mitophagy ved å undertrykke oksidativt stress indusert autophagy. Denne subcellular kupé isolasjon metoden er derfor avgjørende for forståelsen av andre signalnettverk molekyler i tillegg til ERK1/2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viste vi at humanin peptid-mediert ERK1/2 aktiveringen skjer i to forskjellige celletyper, og den subcellular lokaliseringen av aktivert ERK1/2 kan være forskjellig avhengig av forholdene (f.eks, dose peptid, tidspunkt og celle type). Det har vist at humanin signalene via to forskjellige reseptorer22,23, noe som kan forklare forskjellene i signalering mellom de to linjene samt behovet for forskjellige doser av humanin. Fysiologiske implikasjonene av…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en Ellison/AFAR postdoktorstipend i aldring forskningsprogram som SJK, og en Glenn Foundation Award og NIH tilskudd til PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alle forfattere vises i filmen.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referências
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death–apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK–a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
