Subcellulär fraktionering för ERK aktivering vid mitokondrie-derived peptid behandling
Summary
Det här protokollet beskriver hur man stimulera celler med mitokondrie-derived peptider och bedöma signalering kaskad och lokalisering av phospho-proteiner.
Abstract
Mitokondrie-derived peptider (MDPs) är en ny klass av peptider som kodas av små öppna läsning ramar inom andra kända gener av mitokondriella genomet. MDPs har en mängd olika biologiska effekter såsom skydda nervceller från apoptos, förbättra metabola markörer och skydda celler från kemoterapi. Humanin var den första MDP att upptäckas och är den mest studerade peptiden bland familjen MDP. Den membranreceptorer och nedströms signalvägar av humanin har karaktäriserats noggrant. Ytterligare MDPs såsom MOTS-c och SHLP1-6 har upptäckts nyligen och signalering mekanismerna har ännu att belysas. Här beskriver vi en cell kultur baserad metod för att avgöra funktionen av dessa peptider. I synnerhet kan cellen fraktionering tekniker i kombination med western blotting för kvantitativ bestämning av aktivering och flyttning av viktig signalmolekyl. Medan det finns andra metoder för cell fraktionering, är den beskrivs här en enkel och okomplicerad metod. Dessa metoder kan användas för att ytterligare belysa verkningsmekanismen av dessa peptider och andra terapeutiska medel.
Introduction
Nya studier visar att mitokondrie-derived peptider (MDPs) spelar viktiga roller i cytoprotection och metabolism1,2,3. Förstå signalvägen transduktion i närvaro av MDPs ger oss inblick i den mekanism genom vilken MDPs modulera olika funktioner. Den första identifiera MDP, humanin, har visat sig öka extracellulär signal-reglerade Kinas 1/2 (ERK1/2) fosforylering via dess receptor bindande4,5. Nedströms effekten av ERK1/2 aktivering är dock fortfarande underexploaterade.
ERK1/2 kaskad fungerar som en viktig medlare i en mängd olika cellulära processer inklusive spridning, cellmigration, cellulär metabolism, överlevnad och apoptos6,7,8. För att dirigera alla är dessa olika cellulära processer, verksamhet och subcellulär lokalisering av ERK1/2 hårt reglerad av fosfataser och byggnadsställning proteiner9,10. Utöver posttranslationella modifieringar reglerar den dynamiska shuttling ERK1/2 också dess signalering funktion, aktivitet och specificitet11,12. ERK1/2 är främst lokaliserade i cytosolen13. En uppsättning förankring och byggnadsställning proteiner hjälper behålla ERK1/2 i cytoskeletal element, på ytan av organeller eller diffust i cytoplasman13. Vid stimulering, ERK1/2 är fosforyleras och blir skiljas från dess ankring proteiner, vilket gör att på flyttning av ERK1/2 till andra subcellulär fack, inklusive den kärna, mitokondrier, Golgi och lysosomer14, 15 , 16.
Även om humanin är känd för att aktivera den ERK1/2 signalering utbildningsavsnitt, är aktivering av ERK1/2 endast observerats i den totala cell lysates. Som beskrivits tidigare, eftersom ERK1/2 subcellulär lokalisering spelar en avgörande roll i dess nedströms effekt, analys av både subcellulär lokalisering och de totala nivåerna av är fosforylerade ERK1/2 nödvändigt att ge en helhetsförståelse av humanin-inducerad ERK1/2 aktivering och aktivering av nedströms mål.
För att förstå de mål organeller aktiverade ERK1/2, utfördes subcellulär fraktionering följt av western blotting för fosforyleras ERK1/2. Denna metod kan enkelt genomföras som det använder vanlig laboratorieutrustning och reagenser. De isolerade subcellulär fack är av hög renhet, så att resultaten ska tolkas rakt. Immunfärgning av ERK1/2 kan ge liknande resultat. Vissa subcellulär fack är dock relativt svårt att visualisera och kräver speciella fixering och permeabilisering metoder. ERK1/2 varierar i subcellulär fack, och denna variation kan orsaka falskt positiva och falskt negativa signaler när man tittar på hela cellen lysates. Därför ger en immunoblot använder isolerade subcellulär fack oss en bättre förståelse av ERK1/2 lokalisering.
Mångsidigheten hos metoden möjliggör ändringar av protokollet att undersöka effekterna av andra stimulantia inklusive andra MDPs eller flyttning av andra signalmolekyler som STAT3. Nyligen kodas upptäckt små humanin-liknande peptider (SHLPs) från 16S rRNA region där humanin är kodad, och de har liknande men distinkta egenskaper i förhållande till HN17. Till exempel aktivera SHLP2 och SHLP3 ERK1/2 efter 8 h trots humanin aktiverar ERK1/2 inom 5 min. Kontrollera subcellulär lokalisering av ERK1/2 svar på olika peptider kommer att ge oss en bättre förståelse av biologi av dessa peptider. Nya bevis visade att subcellulär lokalisering av signalmolekyler spelar en avgörande roll i deras nedströms effekter. Till exempel STAT3 traditionellt är känt för att vara främst lokaliserade i cytosolen i vilande celler, och sedan det translocates in i cellkärnan att aktivera genuttryck i svar på cytokiner18. STAT3 också translocates till mitokondrier och reglerar TCA cykeln och ATP produktionen19. Angående autofagi förordning modulerar olika subcellulär lokalisering av STAT3 autofagi i olika sätt20. Till exempel kärnkraft STAT3 transcriptionally reglerar autofagi-relaterade gener och fungerar som en autofagi modulator. Cytoplasmiska STAT3 hämmar konstitutivt autofagi genom att interagera med autofagi signalmolekyler. Mitokondriell STAT3 hämmar och hindrar mitophagy genom att undertrycka oxidativ stress induced autofagi. Denna metod för isolering av subcellulär fack är därför avgörande för att förstå rollen som andra signalering molekyler samt ERK1/2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, visat vi att humanin peptid-medierad ERK1/2 aktivering sker i två olika celltyper och subcellulär lokalisering av aktiverade ERK1/2 kan vara olika beroende på villkor (t.ex., det dos av peptid, tidpunkt och cell typ). Det har visats att humanin signaler genom två olika receptorer22,23, vilket kan förklara skillnaderna i signalering mellan de två cellinjer, liksom kravet på olika doser av humanin. De fysiologiska effekterna av detta har inte …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en Ellison/AFAR postdoktorsstipendium i Aging Research Program till Postvagn, och en Glenn Foundation Award och NIH bidrag till PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alla författare visas i filmen.
Materials
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
Referências
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death–apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK–a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
