Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Abstract

Monoklonale Antikörper (mAbs) sind mächtige Werkzeuge nützlich für beide Grundlagenforschung und in der Biomedizin. Ihre hohe Spezifität ist unverzichtbar, wenn der Antikörper sehr ähnliche Strukturen (z.B., ein normales Protein und eine mutierte Version davon) unterscheiden muss. Der aktuelle Weg erzeugen solche diskriminierenden mAbs beinhaltet umfangreiche Screening von mehreren Ab-produzierenden B-Zellen, ist kostspielig und zeitaufwendig. Wir schlagen hier eine schnelle und kostengünstige Methode zur Erzeugung von diskriminierendem, vollständig humaner mAbs ausgehend von menschlichem Blut zirkulierenden B-Lymphozyten. Die Originalität dieser Strategie ist durch die Auswahl der spezifischen Antigen Bindung B Zellen kombiniert mit dem Counter Auswahl aller anderen Zellen, mit leicht verfügbaren peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC). Sobald bestimmte B-Zellen isoliert sind, stammen cDNA (ergänzende Desoxyribonukleinsäure) Sequenzen Codierung für die entsprechenden mAb Einzelzelle Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Technologie und anschließend ausgedrückt in der Human- Zellen. Innerhalb von weniger als 1 Monat ist es möglich, Milligramm hochgradig diskriminierend menschlichen mAbs gegen nahezu jede gewünschte Antigen natürlich erkannt durch die B-Zell-Repertoires zu produzieren.

Introduction

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die schnelle und vielseitige Produktion vollständig humaner monoklonaler Antikörper (mAbs) gegen eine gewünschte Antigen (Ag). mAbs sind unverzichtbare Werkzeuge in vielen Grundlagenforschung Anwendungen in Vitro und in Vivo: flow Cytometry, Histologie, Western-Blot und blockierende Experimente zum Beispiel. Darüber hinaus werden mAbs mehr und mehr in der Medizin zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Transplantation Ablehnung¹Steuern eingesetzt. Anti-CTLA-4 und Anti-PD-1 (oder Anti-PD-L1) mAbs dienten zum Beispiel kürzlich als immun Checkpoint-Hemmern bei Krebs-Behandlungen².

Der erste mAbs stammen von Immunglobulin (Ig)-sezernierenden Hybridome aus der Milz Zellen der immunisierten Mäusen oder Ratten gewonnen. Allerdings behindert die starke Immunantwort gegen Murine oder Ratte mAbs ihre therapeutische Anwendung beim Menschen, durch ihre schnelle Abfertigung und die wahrscheinlich Induktion von Überempfindlichkeit Reaktionen³. Um dieses Problem anzugehen, haben teilweise tierisches Eiweiß-Sequenzen von mAbs menschlich, so genannte Chimäre Maus-Mensch oder humanisierte Antikörper erzeugen abgelöst. Diese Strategie verringert sich jedoch nur teilweise Immunogenität, während deutlich erhöht, die Kosten und die Zeit-Skala der Produktion. Eine bessere Lösung besteht darin, menschliche mAbs direkt aus humanen B-Zellen zu generieren und mehrere Strategien hierfür zur Verfügung. Eine davon ist die Verwendung von Phagen oder Hefe Display. Dies umfasst Anzeigen Variable Domänen aus einer kombinatorischen Bibliothek von zufälligen menschlichen Ig schwere und Licht Ketten auf Phagen oder Hefen und Durchführung einer Auswahlschritt mit den spezifischen Antigen des Interesses. Ein großer Nachteil dieser Strategie ist, dass schwere und leichte Kette nach dem Zufallsprinzip verbunden, was zu einer sehr großen Zunahme in der Vielfalt der erzeugten Antikörper sind. Antikörper, die erhalten sind voraussichtlich nicht denen entsprechen, die durch eine natürliche Immunantwort gegen ein bestimmtes Ag entstehen würde. Darüber hinaus sind menschliche Protein-Falte und post-translationalen Modifikationen nicht systematisch in Prokaryoten oder sogar in Hefen reproduziert. Eine zweite menschliche mAb-Produktions-Methode ist die Verewigung der natürlichen menschlichen B-Zellen durch Epstein – Barr-Virus-Infektion oder Ausdruck der Anti-apoptotische Faktoren BCL-6 und BCL-XL⁴. Allerdings ist diese Methode gilt nur für B-Gedächtniszellen und ist ineffizient, dass Screening von zahlreichen mAb-produzierenden verewigt B-Zellen, die nur wenige (wenn überhaupt) mAb-Klone mit der gewünschten Antigen-Spezifität zu identifizieren. Die Methode ist so teuer und zeitaufwändig.

Vor kurzem wurde ein neues Protokoll für die Produktion von menschlichen mAbs von isolierten einzelnen B Zellen⁵beschrieben. Es stützt sich auf eine optimierte einzellige Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Verstärkung der beiden die Heavy – und Lichterkette Codierung Segmente aus einer einzigen sortierten B-Zelle. Darauf folgt das Klonieren und die Expression dieser Segmente in einer eukaryotischen Expressionssystems, wodurch Wiederaufbau vollständig humaner MAB. Dieses Protokoll wurde erfolgreich ausgehend von B-Zellen von geimpften Spendern verwendet. Zellen wurden mehrere Wochen nach der Impfung zu höhere Frequenzen der B-Zellen gerichtet gegen die gewünschte Ag erhalten, und den Zeitaufwand für das screening von⁶geerntet. Anderen vollständig humaner mAbs wurden auch von⁺ (Human Immunodeficiency Virus) HIV-infizierten Patienten⁷ und Melanom Patienten⁸produziert. Trotz dieser Fortschritte gibt es noch keine Verfahren zur Verfügung, die die Isolation der Ag-spezifische B-Zellen unabhängig von ihrer Erinnerung Phänotyp oder Frequenz ermöglicht.

Hier beschriebenen Verfahrens führt zu effizienten ex Vivo Isolation der menschlichen zirkulierenden B-Zellen basierend auf ihre BCR Spezifität, gefolgt von der Produktion von vollständig humaner antigenspezifischen mAbs in hoher Ausbeute und mit einer niedrigen Screening-Zeit. Die Methode ist nicht zu B-Gedächtniszellen oder Antikörper-sezernierenden B-Zellen nach einer Immunantwort induziert beschränkt, sondern kann auch auf das menschliche naive B-Zelle Repertoire angewendet werden. Es funktioniert sogar ab Ag-spezifische B-Zellen bei sehr tiefen Frequenzen ist ein guter Indikator für die Effizienz. Das Prinzip der Methode ist wie folgt: periphere Blut mononukleären Zellen (PBMC) sind mit zwei Tetramers präsentiert das Antigen des Interesses befleckt, jeder gekennzeichnet mit einem unterschiedlichen Fluorochrom (z. B.Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC)), und eine dritte Tetramer präsentiert eine eng verwandte Antigen konjugiert mit einem dritten Fluorochrom (z. B.Brillant violett 421 (BV421)). Um für Antigen-bindenen Zellen anzureichern, Zellen werden dann mit Perlen mit Anti-PE beschichtet inkubiert und Anti-APC Abs, und in Zelle Trennung Spalten sortiert. Die APC PE^{+ +} Zelle Bruchteil ausgewählt ist, gebeizt mit einer Vielzahl von mAbs spezifisch für verschiedene PBMC Zelltypen zur Identifizierung von B-Zellen und unterworfenen Zytometrie Zellsortierung fließen. B-Zellen sind PE⁺ und APC⁺, aber brillant violett^–, sind isoliert. Dieser Schritt wählt gegen Zellen, die nicht B-Zellen oder binden Sie nicht an die tetramerized Antigen, sondern binden PE oder APC (diese Zellen werden PE⁺ APC^– oder PE^– APC⁺) oder zum Teil nicht-Antigen der Tetramers verwendet (diese Zellen werden BV421⁺). B-Zellen nicht hochspezifisch für das Epitop von Interesse sind auch Counter bei diesem Schritt ausgewählt (diese Zellen werden auch BV421⁺). Somit kann diese Methode hochspezifische B-Zellen, B-Zell-Rezeptoren (BCR) in der Lage ist zu unterscheiden zwischen zwei eng verwandte Antigene ausdrücken reinigen. Einzelne spezifische B-Zellen sind in Tuben gesammelt und ihre PCR verstärkt Ig cDNAs (ergänzende Deoxyribonucleic Säuren) geklont und durch eine menschliche Zelllinie als sekretierten IgG mAbs ausgedrückt.

Diese Studie beschreibt, wie ein Proof of Concept, die effiziente Erzeugung von menschlichen mAbs, die erkennen, eine Peptid mit einem großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül und kann unterscheiden dieses Peptid und anderen Peptiden beladen auf dem gleichen MHC-ich Allel. Obwohl der Grad der Komplexität dieser AG wichtig ist, können mit dieser Methode (i) high-Yield-Rückgewinnung von Ag-spezifische mAbs; (Ii) Produktion von mAbs in der Lage, zwischen zwei strukturell enger Ags zu unterscheiden. Dieser Ansatz zu geimpften oder infizierten Patienten ohne jegliche Änderung Protokoll erweitert werden und hat auch bereits in einem humanisierten Ratte System⁹erfolgreich umgesetzt. Diese Studie beschreibt also, eine vielseitige und effiziente Vorgehensweise um vollständig humaner mAbs, die verwendet werden können in Grundlagenforschung und Immuntherapie zu generieren.

Protocol

Alle menschlichen peripheren Blutproben stammen von anonymen Erwachsenen Spendern nach Einwilligung gemäß der lokalen Ethikkommission (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, Verfahren Les NTS-2016-08). 1. Isolierung der menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen Hinweis: Ausgangsmaterial kann insgesamt menschlichen peripheren Blut oder Cytapheresis Proben sein. Proben sollten nicht älter als 8 h sein und mit Antikoagulantien (z.B. Heparin) er…

Representative Results

Ausgehend von PBMC von gesunden Spendern dieses Projekt stellt die Erzeugung von menschlichen mAbs, die das Peptid Pp65495 erkennen (Pp65, von menschlichen Zytomegalievirus) durch die großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül HLA – A * 0201 () HLA-A2). Diese mAbs können zwischen diesem Komplex und aus anderen Peptiden verladen der gleichen MHC-komplexe unterscheiden-ich Molekül. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"…

Discussion

Das vorgeschlagene Protokoll ist eine leistungsfähige Methode für die Erzeugung von menschlichen mAbs direkt vom Ag-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden. Es vereint drei wichtige Aspekte: (i) die Verwendung von ein Tetramer-assoziierte magnetische Anreicherung, wodurch eine ex-Vivo -Isolierung auch seltene Ag-Bindung B-Zellen; (Ii) eine gating Strategie, die drei Ag-Tetramers (zwei relevante und irrelevante eins) beschriftet mit drei verschiedenen Fluorochromes verwendet, um durch Durchflusszytometrie, …

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
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3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
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5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
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5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
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5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003