Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Summary

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Abstract

Anticorpos monoclonais (mAbs) são poderosas ferramentas úteis para ambas as pesquisas fundamentais e em biomedicina. Sua alta especificidade é indispensável quando o anticorpo precisa distinguir entre estruturas altamente relacionadas (por exemplo, uma proteína normal e uma versão mutante respectivas). A maneira atual de gerar tais discriminatórios mAbs envolve extensa seleção de várias células B produtoras de Ab, que é caro e demorado. Propomos aqui um método rápido e econômico para a geração de discriminativa, mAbs plenamente humano a partir de sangue humano circulam os linfócitos B. A originalidade desta estratégia é devido a seleção de células de ligação B antígeno específico combinado com a Counter-seleção de todas as outras células, usando prontamente disponível periférico sangue mononucleares células (PBMC). Uma vez que células B específicas são isoladas, sequências de cDNA (complementar ácido desoxirribonucleico) que codifica para o mAb correspondente são obtidas usando a tecnologia de célula única reverso transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) e posteriormente expressos em humanos células. Dentro de menos de 1 mês, é possível produzir miligramas de mAbs humana altamente discriminativa, dirigido contra praticamente qualquer antígeno desejado naturalmente detectado pelo repertório de células B.

Introduction

O método descrito aqui permite a produção rápida e versátil de totalmente humanas-anticorpos monoclonais (mAbs) contra um antígeno desejado (Ag). Celia é ferramentas essenciais em muitas aplicações de investigação fundamental em vitro e em vivo: fluxo cytometry, histologia, mancha ocidental, bloqueio e experimentos, por exemplo. Além disso, mAbs estão sendo usados cada vez mais na medicina para tratar doenças auto-imunes, câncer e controle de rejeição de transplante¹. Por exemplo, mAbs anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) foram recentemente usados como inibidores de ponto de verificação imune em tratamentos de câncer².

Os primeiros mAbs foram produzidos por imunoglobulinas (Ig)-secretoras de hibridomas obtidos a partir das células no baço de ratos imunizados ou ratos. No entanto, a forte resposta imune contra murino ou rato mAbs dificulta seu uso terapêutico em humanos, devido a sua rápida liberação e a provável indução de reações de hipersensibilidade³. Para resolver este problema, sequências de proteína animal de mAbs foram parcialmente substituídas por dos humanos para gerar anticorpos chamados de rato-humano ou humanizados quiméricoes. No entanto, esta estratégia apenas parcialmente diminui imunogenicidade, aumentando substancialmente tanto o custo e o tempo-escala de produção. Uma solução melhor é gerar mAbs humano diretamente de células humanas de B e várias estratégias para isso estão disponíveis. Um deles é o uso do fago ou fermento de exibição. Isto envolve exibindo domínios variáveis de uma biblioteca combinatorial de Ig humana aleatória pesado e luz encadeia no fago ou leveduras e realização de uma etapa de seleção usando o antígeno específico de interesse. Uma grande desvantagem dessa estratégia é que correntes pesadas e claras são aleatoriamente associadas, levando a um aumento muito grande na diversidade de anticorpos gerados. Anticorpos obtidos são improváveis corresponder a aqueles que surgem de uma resposta imune natural contra um particular Ag. Além disso, dobradura de proteína humana e modificações borne-translational não são sistematicamente reproduzidas em procariontes ou mesmo em leveduras. Um segundo método de produção humana mAb é o immortalization de células B humanas naturais, pela infecção do vírus Epstein – Barr ou expressão dos fatores anti apoptótica BCL-6 e BCL-XL⁴. No entanto, este método é aplicável apenas às células de memória B e ineficiente, que exige triagem de numerosos mAb imortalizado B células que produzem a identificar os clones mAb poucos (se houver) com a especificidade antigênica desejada. O método é, portanto, caro e demorado.

Recentemente foi descrito um novo protocolo para produção de mAbs humano isolado único B células⁵. Baseia-se em um otimizado monocelulares reverter transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) para amplificação de ambos os pesados e luz-cadeia codificação segmentos a partir de uma única célula B classificada. Isto é seguido pela clonagem e expressão desses segmentos em um sistema de expressão eucarióticos, permitindo assim a reconstrução de um mAb plenamente humano. Este protocolo tem sido usado com sucesso a partir de células B de doadores vacinados. As células foram colhidas várias semanas após a vacinação para obter frequências mais altas de células B dirigidas contra o Ag desejado e, portanto, limitar o tempo necessário para a seleção de⁶. Também foram produzidos outros mAbs plenamente humanos de infectados pelo HIV⁺ (vírus de imunodeficiência humana) pacientes⁷ e melanoma pacientes⁸. Apesar destes avanços, ainda não há nenhum procedimento disponível que permite o isolamento de células B Ag específico independentes de seu fenótipo de memória ou frequência.

O procedimento descrito aqui leva a isolamento eficiente ex vivo de células humanas de B circulantes, com base na sua especificidade BCR, seguida pela produção de plenamente humano mAbs antígeno-específicas em alto rendimento e com um tempo de rastreio de baixo. O método não está restrita a células B de memória ou pilhas de B de desegregação induzidas após uma resposta imune, mas também pode ser aplicado ao repertório B célula humana ingênua. Que funciona mesmo a partir de células B Ag específicos presentes em muito baixas frequências é uma boa indicação de sua eficiência. O princípio do método é como segue: células mononucleares de sangue periférico (PBMC) estão manchadas com dois tetrâmeros apresentando o antígeno de interesse, cada um marcado com um fluorocromo diferente (por exemplo, ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e um terceiro tetrâmero apresentando um antígeno estreitamente relacionado conjugados com um fluorocromo terceiro (por exemplo, Brillant violeta 421 (BV421)). Para enriquecer para ligação de antígeno de células, as células então são incubadas com pérolas revestidas com anti-PE e Abs anti-APC e classificada em colunas de separação de células. A fração de célula APC PE^{+ +} é selecionada, manchadas com uma variedade de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir a identificação de células B e sujeito a classificação de célula de citometria de fluxo. Células B, que são PE⁺ e APC⁺, mas violeta brilhante^–, são isoladas. Esta etapa Counter-seleciona as células que não são células B ou que não se ligam ao antígeno tetramerized, mas vincular a PE ou APC (estas células serão PE⁺ APC^– ou PE^– APC⁺) ou a parte não-antígeno dos tetrâmeros usado (estas as células serão BV421⁺). Células B não altamente específicas para o epítopo de interesse também são Counter-Selecionadodas para esta etapa (estas células também será BV421⁺). Assim, este método pode purificar altamente específicas B celulas que expressam receptores de células B (BCRs) capazes de discriminar entre dois antígenos muito aparentados. Única células B específicas são colhidas em tubos e suas PCR amplificados Ig cDNAs (os ácidos desoxirribonucleico complementares) clonado e expressa por uma linhagem de células humanas como secretada mAbs IgG.

Como uma prova de conceito, este estudo descreve a geração eficiente de mAbs humana, que reconhecem um peptídeo apresentado por uma classe de complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula e podem discriminar entre este peptídeo e outros peptídeos carregados na mesma MHC-eu alelo. Embora o nível de complexidade deste Ag é importante, esse método permite que (i) recuperação de alto rendimento de mAbs Ag-específicos; (ii) produção de mAbs capaz de discriminar entre dois estruturalmente fechar Ags. Esta abordagem pode ser estendida para pacientes infectados ou vacinados sem qualquer modificação do protocolo e também já foi implementada com sucesso em um rato humanizado sistema⁹. Assim, este estudo descreve uma abordagem versátil e eficiente para gerar mAbs totalmente humana que pode ser usado em pesquisa básica e imunoterapia.

Protocol

Todas as amostras de sangue periférico humano foram obtidas de doadores anônimos adultos após consentimento informado, em conformidade com o Comitê de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimento PLER NTS-2016-08). 1. isolamento de células mononucleares de sangue periférico humano Nota: A partir de material pode ser sangue periférico humano total ou cytapheresis amostras. As amostras não devem ter mais de 8 h e suplementado com anti…

Representative Results

Partir de PBMC de doadores saudáveis, presentes neste projeto a geração de mAbs humana, que reconhece o peptídeo Pp65495 (Pp65, do citomegalovírus humano) apresentado pela classe complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula HLA – A * 0201 ( HLA-A2). Esses mAbs podem discriminar entre este complexo e complexos que representam outros peptídeos carregados no mesmo MHC-eu molécula. PBMC foram cor…

Discussion

O protocolo proposto é um método poderoso para a geração de mAbs humano diretamente de células B Ag específicos circulantes no sangue. Ele combina três aspectos importantes: (i) a utilização de um enriquecimento magnético tetrâmero-associados, que permite um isolamento ex vivo de mesmo raras células B Ag-ligação; (ii) uma estratégia associada que usa três tetrâmeros de Ag (dois entes relevantes e um irrelevante) rotulados com três diferentes fluorochromes para isolar, por citometria de fluxo, a…

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
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5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
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5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
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5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
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3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
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5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
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3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
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5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003