Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose

Summary

Osmotische stress beïnvloedt exocytose en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens dit proces. We laten zien hoe elektrochemische methoden samen met transmissie-elektronenmicroscopie combineren kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van extracellulaire osmotische druk op exocytose activiteit, blaasje quantal grootte en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven tijdens exocytose.

Abstract

Amperometry opname van cellen die zijn onderworpen aan osmotische schok Toon die secretoire cellen op deze fysieke stress reageren doordat de exocytose activiteit en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgelaten uit de blaasjes in één exocytose gebeurtenissen. Er is gesuggereerd dat de vermindering in neurotransmitters verdreven als gevolg van wijzigingen in de membraan biofysische eigenschappen is wanneer cellen in reactie op osmotische stress krimpen en met aannames gemaakt dat secretoire blaasjes in het cytoplasma van de cel ondervinden geen problemen door extracellulaire osmotische stress. Amperometry opname van exocytose controleert wat wordt vrijgelaten uit de cellen het moment een blaasje combineert met het plasma-membraan, maar levert geen informatie over de inhoud van het vesikel voordat de fusie blaasje wordt geactiveerd. Daarom biedt opname met andere aanvullende analytische methoden die kunnen karakteriseren de secretoire blaasjes voordat exocytose op cellen wordt geactiveerd door het combineren van amperometry een breder overzicht voor de behandeling van hoe secretoire blaasjes en de Exocytose proces worden beïnvloed door osmotische schok. We beschrijven hier hoe aanvulling amperometry opnemen met intracellulaire elektrochemische cytometry en Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beeldvorming kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de wijzigingen in de grootte en neurotransmitter inhoud secretoire blaasjes op chromaffin cellen ten opzichte van exocytose activiteit voor en na blootstelling aan osmotische stress. Door de koppeling van de kwantitatieve gegevens die experimenten met behulp van alle drie de analytische methoden, werden conclusies eerder gemaakt dat secretoire blaasjes op extracellulaire osmotische stress reageren door inkrimping in grootte en het blaasje quantal grootte te verminderen het handhaven van een constante vesikel neurotransmitter concentratie. Vandaar, dit geeft duidelijkheid over waarom blaasjes, in reactie op osmotische stress, vermindering van de hoeveelheid neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose release. De amperometrische opnames hier blijkt dit een omkeerbaar proces en dat blaasje nadat osmotische schok worden nagevuld met neurotransmitters wanneer geplaatste cellen zijn teruggekeerd in een isotone milieu.

Introduction

Chromaffin cellen in de bijnieren zijn neuro-endocriene cellen die release neurotransmitter moleculen in de bloedstroom. Dit gebeurt door een cellulaire proces waarbij de docking en de fusie van de neurotransmitter gevulde blaasjes, resulterend in de release van de inhoud van blaasjes aan de extracellulaire ruimte in een proces genaamd exocytose. De neurotransmitters (adrenaline en noradrenaline) in chromaffin cellen worden actief getransporteerd door membraaneiwitten in grote dichte kern blaasjes (LDCVs) en opgeslagen bij hoge concentraties (~0.5-1 M)^1,2. Accumulatie van neurotransmitters in de LDCVs wordt bereikt door de affiniteit van catecholamine moleculen naar de intravesicular dichte kern eiwit matrix bestaat uit chromogranin eiwitten (~ 169 mg/mL)^{3,4,5 ,6}, en een intravesicular cocktail oplossing met belangrijke onderdelen voor catecholamine laden en opslag in het vesikel zoals ATP (125-300 mM)⁷, Ca^{2 +} (50-100 µM in de oplossing en een ~ 40 mM gebonden aan de eiwit matrix)⁸Mg^{2 +} (5 mM)⁹, ascorbaat (10-30 mM)¹⁰en een pH van ~5.5^11,12. De LDCVs handhaven een iso-osmotische voorwaarde met de cel cytoplasma (310 mOsm/kg)¹³, hoewel de theoretische opgeloste concentratie binnen de blaasjes optellen tot meer dan 750 mm bedraagt. De samenstelling van de intravesicular componenten is niet alleen essentieel voor het laden en opslaan van catecholamines, maar ook voor samenvoeging van opgeloste stoffen naar de dichte kern eiwit matrix. Dit vermindert het installatieprogramma de osmolariteit van de blaasjes aanzienlijk verminderd en kan invloed hebben op het bedrag catecholamine die is uitgebracht tijdens exocytose^5,6.

Studies over het effect van extracellulaire osmotische druk op het proces van exocytose door amperometrische opname hebben gemeld dat hoge extracellulaire osmotische druk remt exocytose activiteit en vermindert het aantal neurotransmitters uitgescheiden door één vesikel compartimenten^{4,14,15,16,17,18,19}. De uitleg van deze opmerkingen hebben gespeculeerd over de mogelijke verbetering van macromoleculaire verdringing in de cel cytoplasma remmende vesikel fusion gebeurtenissen, en een wijziging in de membraan biofysische eigenschappen waardoor het aantal neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose. Deze gedachten verondersteld dat hoge extracellulaire osmotische stress niet afdoet aan het blaasje quantal formaat, waarin het aantal moleculen van de neurotransmitter opgeslagen in een blaasje compartiment voorafgaande stadium van geactiveerde exocytose^{14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21}. in amperometrische metingen van exocytose release in afzonderlijke cellen, een koolstofvezel schijf micro-elektrode in nauw contact met het celoppervlak, maken een experimentele opgericht nabootsen van de configuratie van de synaps wordt geplaatst waar de amperometrische elektrode fungeert als een postsynaptisch detector (Figuur 1)^22,23. Door het stimuleren van een cel exocytose, kan een neurotransmitter gevulde blaasjes te smelten met de celmembraan van plasma en vrijgeven van de volledige vesikel inhoud geheel of gedeeltelijk in de extracellulaire ruimte veroorzaken. Deze neurotransmitter moleculen vrijgegeven aan het oppervlak van de elektrode kunnen elektrochemisch worden gedetecteerd als de neurotransmitters electroactive (bijvoorbeeld, catecholamines zijn) door toepassing van een redoxpotentiaal meet van +700 mV vs een Ag/AgCl-elektrode . Daarom een aantal huidige spikes markeren de detectie van individuele exocytose gebeurtenissen. Van de huidige versus tijd traceren in een amperometrische-opname, het gebied onder elke één amperometrische spike vertegenwoordigt de lading per exocytose evenement gedetecteerd en kan worden geconverteerd naar het molletje van neurotransmitters uitgebracht, met behulp van de vergelijking van Faraday. Vandaar, de opnames amperometrische kwantitatieve informatie verschaffen over de hoeveelheid neurotransmitters verdreven uit één exocytose gebeurtenissen en verslag over de frequentie van exocytose gebeurtenissen, maar vertonen geen kwantitatieve informatie over de secretoire blaasjes inhoud voordat vesikel fusion en neurotransmitter release is ingeleid.

Dus, om een beter begrip van hoe secretoire blaasjes in de cel cytoplasma reageren op extracellulaire osmotische stress voordat de cel wordt geactiveerd om te ondergaan exocytose, andere aanvullende analytische methoden kunnen worden gebruikt om deze informatie te verrijken. Bijvoorbeeld, om te onderzoeken als osmotische stress vesikel volume verandert, kan transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) imaging analyse worden gebruikt voor het meten van het vesikel grootte van cellen na chemische fixatie. Om te onderzoeken of osmotische stress beïnvloedt vesikel quantal grootte, een techniek van de onlangs ontwikkelde amperometrische genaamd intracellulaire elektrochemische cytometry, kan worden toegepast voor de kwantificering van vesikel neurotransmitter inhoud op secretoire blaasjes in hun geboortestaat toen nog woonachtig in het cytoplasma van levende cellen²⁶. In de intracellulaire elektrochemische cytometry techniek, een nanotip cilindrische koolstofvezel elektrode zachtjes wordt ingevoegd in het cytoplasma van levende cellen en door het toepassen van een potentieel +700 mV op deze elektrode (versus een Ag/AgCl referentie elektrode), de Catecholamine inhoud in blaasjes kan worden gekwantificeerd door de detectie van een redox huidige piek van enkele blaasjes botsen, adsorberend, en vervolgens stochastically te bezwijken aan de elektrode oppervlakte en daardoor het vrijgeven van hun inhoud tegen de elektrode oppervlakte²⁶. Vandaar, in de huidige versus tijd trace amperometrische, elk één vesikel rupturing evenement kan resulteren in een huidige voorbijgaande aard en door de integratie van het gebied van elke huidige spike, de vesikel quantal grootte kan worden berekend met behulp van Faraday´s-wet.

Dus door het koppelen van de kwantitatieve informatie opgedaan vesikel grootte metingen met behulp van TEM imaging samen met blaasje quantal grootte analyse, zoals geregistreerd door intracellulaire elektrochemische cytometry, kan blaasje neurotransmitter concentratie ook worden bepaald. Dit maakt de karakterisering van het vesikel wanneer cellen worden blootgesteld aan verschillende osmotische omstandigheden en biedt een betere blik op hoe de blaasjes op extracellulaire osmotische stress in het stadium vóór de exocytose reageert. De resultaten van combinatie van deze methoden hebben aangetoond dat in aanwezigheid van extracellulaire hoge osmotische druk, blaasjes krimpen en hun quantal grootte aanpassen en vergelijken van de kwantitatieve informatie over de relatieve veranderingen van deze metingen dat blijkt tijdens het krimpen wijzigen blaasjes hun inhoud en het formaat te handhaven van een constante neurotransmitter concentratie²⁴. Dus, dit inzicht is waardevol bij het aansluiten van de opmerkingen over neurotransmitter vrijlating in cellen die zijn blootgesteld aan osmotische stress. In deze protocollen beschrijven we het gebruik van deze drie complementaire methoden waarmee de karakterisatie van hoe secretoire blaasjes in hun oorspronkelijke omgeving reageren op extracellulaire osmolaliteit en de gevolgen van deze reactie op de exocytose proces. Naast onze eerdere opmerkingen over het effect van hoge osmotische druk op exocytose²⁴presenteren we extra experimenten die cel herstel na osmotische schok en het effect van meerdere barium stimulaties in chromaffin beschrijven cellen.

Protocol

1. de celcultuur van boviene Chromaffin cellen geïsoleerd door enzymatische spijsvertering van de bijnieren Isoleren chromaffin cellen verkregen boviene bijnieren, steriliseren cellen met 70% ethanol oplossing. Trim weg vet en bindweefsel met behulp van een scalpel. Om het bloed te verwijderen, spoel de bijnier aderen met behulp van Locke’s oplossing (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) 5,6 mM met een pH van 7,4) die al waterbaden tot 37 ° C. Te…

Representative Results

We beschrijven hier het protocol voor hoe TEM imaging samen met twee elektrochemische methodologieën, koolstofvezel amperometry en intracellulaire elektrochemische cytometry, combineren kunt informeren die krijgt een bredere visie zinspeelt op het effect van extracellulaire osmotische druk op secretoire blaasjes en het proces van exocytose. Door het vergelijken van representatieve amperometrische opnames van exocytose release op één chromaffin cellen met behulp van de experimentele instellen (afgebeeld in <strong clas…

Discussion

Wij presenteren hier een protocol en de voordelen van de combinatie van drie elkaar aanvullende analytische methoden om secretoire blaasjes en het proces van exocytose te krijgen een beter begrip van hoe een fysieke kracht zoals osmotische druk secretoire blaasjes beïnvloeden kan te analyseren en het proces van exocytose in secretoire cellen. Deze methoden omvatten koolstofvezel micro-elektrode amperometry, die een gevestigde methode is voor het opnemen van exocytose activiteit, intracellulaire elektrochemische cytometr…

Materials

NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB