Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem
Summary
Hier beschrijven we een driedimensionale cultuur-methode voor het analyseren van de morfologie van primaire borstkankercellen, alsmede over de studie van hun directe/indirecte interacties met monocyten en de resultaten zoals de aantasting van het collageen, immuun cel aanwerving, cel invasie, en bevordering van kanker-gerelateerde ontsteking.
Abstract
Ingebed in de extracellulaire matrix (ECM), communiceren normale en neoplastisch epitheliale cellen intiem met hematopoietische en niet-hematopoietische cellen, dus sterk beïnvloeden van normale weefsel homeostase en ziekte resultaat. Bij borstkanker spelen tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) een cruciale rol in de progressie van de ziekte en metastase herhaling; inzicht in de mechanismen van de monocyte chemoattraction de tumor communicatie en hun interacties met tumorcellen is daarom belangrijk ter bestrijding van de ziekte. Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een driedimensionale (3D) mede cultuur systeem van menselijke (BrC) borstkankercellen en menselijke monocyten. BrC cellen geproduceerd gereglementeerde op-activering basale hoge, normale T-cel uitgedrukt en uitgescheiden (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) en granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (G-CSF), terwijl in co-cultuur met monocyten, pro-inflammatoire cytokines Interleukine (IL) -1 beta (IL-1β) en IL-8 werden verrijkt met matrix metalloproteinasen (MMP) -1, MMP-2 en MMP-10. Deze tumor stroma communicatie bevorderd weerstand tegen anoikis MCF-10A 3D acini-achtige structuren, chemoattraction van monocyten en invasie van agressieve BrC cellen. De hier gepresenteerde protocollen bieden een betaalbaar alternatief voor het bestuderen van de mededeling van de intra-tumor en zijn een voorbeeld van het grote potentieel door in vitro 3D cel-systeem is bedoeld om het ondervragen van de specifieke kenmerken van de tumor biologie aan de tumor gerelateerde agressie.
Introduction
Biologie van de tumor is veel ingewikkelder dan eerder gedacht. Montage van bewijsmateriaal blijkt dat tumorcellen meer dan een louter bulk van ongecontroleerde delende cellen zijn; verschillende neoplastische cellen lijken eerder, voor het uitvoeren van verschillende functies hoge organisatie en hiërarchie binnen de tumor-1weer te geven. Tumorcellen zijn ook in intieme communicatie met niet-getransformeerd cellen: macrofagen, lymfocyten, adipocytes, fibroblasten, endotheliale cellen, onder andere cellen zijn alle ondergedompeld in de steiger eiwitten en polysacchariden die de ECM vormen. Talrijke directe en indirecte interacties zijn gevestigd tussen getransformeerd en niet-getransformeerd cellen en met de ECM, die een krachtige invloed op de ziekte resultaat2,3oefent. In het specifieke geval van BrC is het met name belangrijk voor het ontleden van de mededeling van BrC cellen met TAMs, gezien het feit dat TAMs bleken te spelen een cruciale rol in de evolutie van de tumor, waardoor het risico van metastase en ziekte herhaling4 ,5.
Voor het analyseren van de intra-tumoral interacties en hun mogelijke uitkomsten, nieuwe 3D in vitro benaderingen zijn ontwikkeld op basis van het gebruik van ECM-extracten die een veel complexer communicatie bieden, dichter bij de realiteit van de biologie van de tumor, in vergelijking met de conventionele enkelgelaagde celculturen waarin de cellen groeien gekoppeld aan kunststof. Petersen en Bissell6 geleverd het eerste model van nonmalignant en kwaadaardige borstklier epitheliale cellen gekweekt op een laminin-rijke kelder membraan en waren de eerste om te beschrijven van de 3D organotypic-structuren die nonmalignant mens discrimineren borst epitheliale cellen uit hun kwaadaardige tegenhangers. Een decennium later, het model ontwikkeld door Debnath, Muthuswamy, en Brugge7,8,9 verstrekt een waardevol instrument voor het verhelderen van de biologische trajecten in gevaar komen tijdens de kwaadaardige omzetting van klierweefsel acini, dergelijke Als grote acini formatie als gevolg van de ongecontroleerde verspreiding, verplaatsing van strakke junction eiwitten als bewijs van verminderde cel polarisatie, en verlies van acini lumen als gevolg van cel weerstand tegen anoikis, een soort geprogrammeerde celdood optreedt die in Anchorage-afhankelijke cellen wanneer ze van de omliggende ECM losmaken. De modellen Sameni, Jedeszko en Sloane hebben gericht op imaging proteolytic activiteit door cellen, die nauw is aan invasiviteit, een ander essentieel karaktertrek van tumor maligniteit10,11,12 verwant. Deze modellen afhankelijk proteïne matrices gemengd met verschillende fluorescentie-uitgeblust eiwit substraten (DQ-gelatine, DQ-collageen I, en DQ-collageen IV), in welke TL signalen zijn indicatief voor de Proteolytische afbraak van collageen. 3D-modellen worden ook gebruikt voor het bestuderen van de stamcel eigenschappen van zowel niet-getransformeerd en tumorcellen, in welke cel aggregaten, ook wel genoemd spheroïden, kunnen worden gekweekt in suspensie of in ECM-achtige eiwitten voor mechanismen voor celdifferentiatie, asymmetrische ondervragen celdeling, naleving van de cel-naar-cel en cel motiliteit13,14. Invasie testen laten testen van de intrinsieke agressiviteit van de tumor en de identificatie van de moleculen die als chemoattractants tijdens de invasieve proces15 dienen. Algemene, 3D-modellen vertegenwoordigen een betaalbare diversificatie van in vitro cultuur van de cel die normaal en oncogene weefsel morfogenese nauwer te weerspiegelen.
We hebben een 3D co celcultuur op grond van de bovengenoemde modellen7,10,11, ontworpen met behulp van beide menselijke commerciële BrC cellijnen van bekende agressieve potentieel (luminal en triple-negatieve soorten) en primaire cellen transplanteren van BrC patiënten. We eerst een model ontwikkeld waar niet-agressieve (MCF-7) of agressieve (MDA-MB-231) BrC cellen waren mede gekweekte met U937 monocyten in een uittreksel van de extracellulaire matrix (ECME)-gebaseerde 3D systeem waardoor directe cel interacties. Deze co culturen werden gebruikt om te bepalen hoe de communicatie tussen deze twee cel lineages beïnvloed de transcriptie van een aantal genen aan agressief gedrag van kanker gerelateerde. Een aanzienlijke stijging van cyclooxygenase-2 (COX-2) afschrift werd waargenomen dat samenviel met een verhoogde productie van een van haar producten, prostaglandine E2 (PGE2), de vaststelling dat de rol van ontsteking in de progressie van kanker benadrukte. Verhoogde transcriptie van MMP werd ook waargenomen dat gecorreleerd met meer collageen proteolyse wanneer agressieve MDA-MB-231 cellen samen met U937 monocyten in DQ-collageen IV-bevattende culturen werden gekweekt. Van de nota, heeft onze mede culturen geen ondersteuning voor de veronderstelling dat cel-cel interactie mechanismen nodig zijn om aantasting van het collageen. Het eerder gesuggereerd dat de communicatie tussen de twee cel lineages was gemedieerd door secreted moleculen. Bovendien bevatte het supernatant geoogst van deze co cultuur assays oplosbare factoren die klieren acini gevormd door niet-getransformeerd MCF-10A cellen13ongeorganiseerd. Bleek dat agressieve en primaire BrC cellen uitgescheiden verhoogde niveaus van monocyt Chemotactische moleculen MCP-1, GM-CSF, en RANTES. Dus, we geschetst een 3D cultuur waarin cellen werden gescheiden in cel cultuur inzetstukken ter voorkoming van cel-cel interacties. Deze culturen werden gebruikt om aan te pakken van de indirecte communicatie tussen BrC cellen en monocyten. Voor deze tests, niet-agressieve en agressieve commerciële BrC cellijnen en primaire BrC cellen en drie verschillende soorten menselijke monocyten: commerciële U937 en THP-1 cellen en primaire monocyten (PMs) geïsoleerd uit perifeer bloed van gezonde donoren (alle monocyten werden gebruikt in een niet-geactiveerde staat) werden gebruikt. Verhoogde concentraties van inflammatoire cytokines IL-1β en IL-8 werden waargenomen worden verrijkt in co-cultuur. Ook bleek dat MMP-1 en MMP-2 MMP-10 werden eveneens verhoogd in het BrC cellen-monocyt co culturen, en daarmee versterken eerdere bevindingen14. In dit manuscript, wordt een punt-voor-punt workflow van primaire BrC cellen isolatie en testen in 3D culturen gepresenteerd samen met representatieve resultaten. Dit werk vormt een goed voorbeeld van het grote potentieel door in vitro 3D cel-systeem is bedoeld om specifieke aspecten van de biologie van de tumor te ondervragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitheliale cellen groeien in een 3D ruimtelijke bevleesdheid en hun interactie met de ECM-eiwitten is cruciaal voor de weefsel homeostase. Veel kanker studies zijn gebaseerd op cellen gekweekt in monolayers (2D) en hoewel ze kritische geweest tot begrip van vele aspecten van tumor ontstaan en progressie, monolayers doen niet recapituleren de kenmerken die de ECM oplegt aan cellen, voor aanleg: beperken van de proliferatie, overleving van de cel adhesie-afhankelijke apicale-basolaterale polariteit, ECM remodelleren, celd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE Project nr. 233061 naar Ezequiel M. Fuentes-Pananá en door Fondo de Apoyo a la Investigación, ziekenhuis Infantil de México Federico Gómez (projectnummer HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez nb is een promovendus from Programa de Doctorado nl Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM) en ontvangen fellowship 231663 van CONACYT. E-S NA, ook erkennen dat de financiële steun van het Mexicaanse Instituut voor sociale zekerheid (IMSS).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
Referências
- Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
- Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
- Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
- Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
- Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
- Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
- Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
- Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
- Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
- Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
- Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
- Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).
