キャピラリー配列で複数の核酸の視覚的検出
Summary
このプロトコルでは、操作が簡単です、1 つのテストで複数の核酸の視覚的検出に適用することができます小さなに使えるカセットの製作について説明します。このアプローチでキャピラリー配列は遺伝子組み換えターゲットの多重化・高能率化の検出に使われました。
Abstract
病気の診断、微生物モニタリング、遺伝子組み換え作物 (GMO) 検出でマルチ ターゲット、短時間、および単一のテストを動作するように簡単に複数の核酸の検出のためリソース手頃な方法論が急務とフォレンシック分析。以前 calm (Capillary Array ベースLoop lamp 法核酸のMultiplex の視覚的検出の) プラットフォームを説明しました。ここで、改良試作し、このプラットフォームのパフォーマンス プロセスについて述べる。ここでは、核酸の多重の視覚的検出のためのキャピラリー配列によって組み立てられる小さい、すぐ使えるカセットを適用されます。キャピラリー配列で毛細血管ループ lamp 法 (ランプ) のプライマー セットを修正する前に疎水性と親水性パターンに前処理をされます。読み込みアダプターの組立後ランプ反応混合物が読み込まれ、1 回のピペッティング操作によって毛管力によるそれぞれの毛細血管に分離します。ランプの反応は、毛細血管に並列で実行されます。結果は手持ち UV 懐中電灯照明による視覚的に読み取られます。このプラットフォームを使用すると、頻繁に高い特異性と感度要素と GMO サンプルの遺伝子を登場 8 の監視を紹介します。要約すると、記載プラットフォームは複数の核酸の検出を容易にするものです。高スループット核酸分析が必要な分野で広く適用可能と考えています。
Introduction
臨床診断1,2,3, GMO 検出4などの分野の広い範囲で複数の核酸の同時検出のための低コスト、迅速、かつ使いやすいシステムが急務します。 5,6、微生物、特にポイント ・ オブ ・ ケア検査 (POCTs)、フォレンシック分析10,11,7,8,9の監視リソース通常限られた12,13,14はします。
ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、リアルタイム PCR およびマルチプレックス PCR 派生メソッドを含む、これらのフィールドで検出するための最も広く応用テクニックです。ただし、これらの方法通常のみ検出ターゲットを 1 つ 1 つテスト15で、電気と高度な専門機器を要求します。
核酸を検出するための別の有望な技術はループ lamp 法 (ランプ) は最初に 2000年16で説明します。ランプは、高効率遺伝子検出法です。理論的には、一定温度、(すなわち60-65 ° C の間) で行うすべて 1 時間以内 amplicons 109枚に 1 コピーから増幅することができますそれ。成功した増幅は不溶性副産物ピロリン酸の大量を生産し、濁度17を直接肉眼で観測することができるの変化を引き起こします。金属イオンや水酸基ナフトール ブルー20や核酸色素19、18カルセインの蛍光染料添加による色の変化がご覧いただけます。高感度の利点と操作の利便性のためランプが広く核酸の検出に適用されています。
現在、マルチプレックスアッセイ ランプの主に 2 つの方法があります。複数のランプを持っていることによって複数のランプの試金を実行することです 1 つ 1 つの管21,22,23のプライマーを設定します。しかし、多様性と増幅効率は、本質的な干渉と異なるプライマー セット間の競争によって制限でしょう。さらに、同じ反応の異なるランプ製品を識別するために困難になることができます。別の戦略は、物理的な分離に基づいています。個々 の小型コンパートメントに隔離された異なるプライマー セットと複数のランプの反応が同時に実行されます24,25。マイクロ流体チップに基づいています一般的に、これらのアプローチは、高スループット ランプ反応の潜在的なソリューションを提供します。しかし、チップの製造とプライマー セットの多重塗装の前処理は複雑で、コストが増加して再現性を減少させる可能性があります。
最近では、いくつかの研究は、マイクロ流体チップの複雑な加工をバイパスして、低コストの検出26,27を達成している毛細血管で実行するランプの反応を説明しています。ただし、ハイスループット分析に関してこれらの毛細血管に似ている PCR ストリップ管のミニチュア版サンプルと反応試薬 (異なるプライマー セットを含む) する必要がありますであるため個別に準備および別に配信毛細血管内の反応ユニット。並列とマルチプレックス解析を達成するために追加の機器、たとえばマルチ チャンネルのシリンジ ポンプはサンプルや試薬の並列読み込みに必要。
核酸の多重検出のための現在の方法に関連付けられている制限を克服するためには、キャピラリー配列とビジュアルのランプ技術を組み合わせた小型のプラットフォームを行った。このプラットフォームは、マルチ ターゲット、コンパクト サイズ、低コスト、および28を動作するように簡単です。ここで、キャピラリー アレイを作製し、配列のランプ反応を実行する方法の詳細について述べる。モデルとして遺伝子組み換え作物 (GMO) の検出を使用してここで説明されているプロトコルが標準化されました。重要なは、このプロトコルは、他の核酸ターゲットのハイスループット検出にも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ランプ技術を組み合わせたキャピラリー配列、単一の非常に効果的かつ簡単にテストの操作で複数の GMO 関連遺伝子ターゲットの同時検出を有効に穏やかなプラットフォームは、ここで示します。
カセットで多重ランプ反応を正常に実行、3 つの重要なポイントが注目される必要があります。まず、毛細血管の上側とキャピラリー配列の親水性と疎水性のパターンの同じ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
新世紀優秀な才能のため、国立自然科学財団の中国の補助金 (31370813、3147670、31670831、31600672、)、国民のトランスジェニック植物特別基金 (2016ZX08012-003、005 2016ZX08012)、プログラムによって本研究は一部で賄われて大学、主要研究と中国 (2016YFA0500601) および中国ポスドク科学財団 (2016 M 591667) の開発プロジェクトです。
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
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