毛细管阵列中多核酸的视觉检测
Summary
该协议描述了一个小的, 现成的卡带的制作, 可用于视觉检测的多个核酸在一个单一的测试, 这是易于操作。在这种方法中, 用毛细管阵列对转基因生物的目标进行多重和高效的检测。
Abstract
在疾病诊断、微生物监测、转基因生物体 (转基因) 检测中迫切需要多目标、短期和资源可承受的多种核酸检测方法, 并法医分析我们先前描述的平台称为平静 (Capillary Array-based Loop 介导的等温放大为Multiplex 视觉检测核酸)。在此, 我们描述了改进的制造和性能的过程, 这个平台。在这里, 我们应用一个小的, 现成的磁带组装的毛细管阵列的多重视觉检测核酸。毛细管阵列被预处理成疏水和亲水模式之前固定环介导的等温放大 (灯) 底漆集在毛细管。加载适配器组装后, 灯反应混合物被加载和孤立到每一个毛细管, 由于毛细管力由一个单一的移步骤。灯的反应在毛细血管中平行进行。结果是视觉读出的照明与 hand-held 紫外线手电筒。利用这个平台, 我们展示了对8种常见的元素和基因在转基因样品中具有高特异性和敏感性的监测。总之, 本文所描述的平台是为了方便检测多种核酸。我们相信它将广泛应用于需要高通量核酸分析的领域。
Introduction
在广泛的领域, 如临床诊断1、2、3、转基因检测4, 对多种核酸同时检测的系统来说, 需要低成本、快速且易于使用. 5,6, 微生物监视7,8,9, 鉴证分析10,11, 特别是点测试 (POCTs), 其中资源通常被限制为12,13,14。
聚合酶链反应 (pcr), 包括其衍生物方法 real-time pcr 和多重 pcr, 是最广泛应用于这些领域的检测技术。但是, 这些方法通常只在一个测试15中检测一个目标, 并且需要电力和复杂的专业设备。
另一个有前途的技术检测核酸是环介导的等温放大 (灯), 这是第一次描述在 2000年16。灯是一种高效的 DNA 检测方法。理论上, 它可以放大1拷贝到 109副本的增在一个小时内, 所有执行在一个恒定的温度, (即, 在 60-65 ° c)。成功的放大将产生大量的不溶性副产品焦磷酸盐和导致混浊的变化17, 这可以直接观察肉眼。还可以通过添加金属离子或荧光染料 (如素18、核酸染料19和羟基萘酚蓝20) 来观察颜色的变化。由于光源具有灵敏度高、操作方便等优点, 在核酸检测中得到了广泛的应用。
目前, 多路灯检测主要有两种策略。一是通过在一管21,22,23中的多个灯引套进行多灯检测。然而, 由于不同引物间的内在干扰和竞争, 其多样性和放大效率将受到限制。此外, 在同一反应中, 很难识别出不同的灯具产品。另一个策略是基于物理隔离。不同的引物集合被隔绝了入各自的小型化隔间, 并且多个灯反应然后同时执行24,25。这些方法, 通常是基于微流控芯片, 提供了一个潜在的解决方案的高通量灯的反应。然而, 生产的芯片和复合预的底漆集是复杂的, 这可能会增加成本和减少重复性。
最近, 有几项研究描述了在毛细血管中执行灯反应以绕过复杂的微流控芯片制造, 并实现了低成本检测26,27。然而, 在高通量分析中, 这些毛细血管与 PCR 条管的微型版本类似, 因为样品和反应试剂 (包括不同的底漆) 必须单独准备并送到不同毛细血管内的反应单位。为了实现并行和复用分析, 需要额外的设备, 例如多通道注射器泵, 是平行装载样品或试剂。
为了克服目前核酸多重检测方法的局限性, 我们开发了一种将视灯技术与毛细管阵列相结合的小型化平台。该平台具有多目标、体积小巧、成本低廉、易于操作的28。在此, 我们描述了如何制造毛细管阵列和执行在阵列中的灯反应的细节。这里描述的协议已被标准化使用转基因生物 (转基因) 检测作为一个模型。重要的是, 这个协议也可以用于高通量检测其他核酸靶。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里展示的平静平台, 它结合了灯技术与毛细管阵列, 使同时检测多个转基因相关的基因目标在一个单一的, 高效, 易于操作的测试。
为了在卡带中成功地执行复用灯的反应, 需要注意三关键点。首先, 达到相同的高度, 在毛细血管的上部和亲水性和疏水性模式的毛细管阵列是关键的同时加载试剂到所有的毛细血管。在初始插入到 “支持” 后, 毛细血管应由一个板对齐, 以确保它们?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究部分由国家自然科学基金资助 (31370813、3147670、31670831和 31600672)、国家转基因植物专项基金 (2016ZX08012-003、2016ZX08012-005)、新世纪优秀人才项目大学, 中国国家重点研究开发项目 (2016YFA0500601) 和中国博士后科学基金 (2016M591667)。
Materials
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
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