Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.
In het centrale zenuwstelsel, talrijke acute verwondingen en neurodegeneratieve aandoeningen, zo goed als geïmplanteerde apparaten of biomaterialen ontworpen ter verbetering van het resultaat van de functie in dezelfde uitkomst: overmaat ontsteking leidt tot gliosis, cytotoxiciteit, en/of vorming van een gliale litteken dat collectief schade verergeren of voorkomen van gezond herstel. Met de bedoeling van het creëren van een systeem model gliale litteken vorming en studie inflammatoire processen, hebben we een geschikt voor huisvesting van primaire gekweekte gliacellen 3D cel-steiger gegenereerd: microglia die de reactie van het buitenlandse lichaam reguleren en initiëren de inflammatoire gebeurtenis astrocyten die reageren op een vezelig litteken vormen en oligodendrocyten die meestal kwetsbaar voor inflammatoire letsel zijn. Het huidige werk biedt een gedetailleerde stapsgewijze methode voor de fabricage, cultuur en microscopisch karakterisering van een hyaluronzuur-gebaseerde 3D hydrogel steiger met ingekapselde rat gliale cellen van hersenen-afgeleide. Verder, protocollen voor karakterisering van cel inkapselen en de hydrogel steiger door confocal immunofluorescentie en scanning elektronen microscopie zijn aangetoond, evenals de capaciteit om te wijzigen de steiger met bioactieve substraten, met opneming van een commerciële basale lamina mengsel verbeterde cel integratie.
Ontsteking van het centrale zenuwstelsel (CNS) heeft lang beschouwd als een stempel van acute (b.v., ischemische beroerte, traumatische hersenen en ruggenmerg letsel) en chronische (zoals Alzheimer, Parkinson van en Huntingtons ziekten) CNS letsel, maar wordt steeds meer erkend als een causale bijdrage aan neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. Opgelopen of ongepaste ontsteking kan veroorzaken van neurale letsel en demyelinisatie (bv . multiple sclerose), en negatieve invloed hebben op de ontwikkeling van de hersenen (bijvoorbeeld, schizofrenie, autisme) en stemming Staten (bijvoorbeeld, depressie, angst bipolaire stoornis). Verdere, nieuwe therapeutische strategieën door middel van de implanteerbare hulpmiddelen (bv., hersenen-computer-interfaces1,2,3, diepe brein stimulatie4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) genereren van een voorspelbare inflammatoire respons op het raakvlak tussen het apparaat en de CNS wat resulteert in een beschermende weefsel antwoord dat leiden verlies van niet-werkzaamheid of apparaat gedurende de levensduur van de prothese11 tot kan. Ontsteking in het VNV wordt meestal geïnitieerd door microglia, die fungeren als de resident immuuncellen van het centraal zenuwstelsel die verantwoordelijk zijn voor weefsel surveillance en montage van de vreemd lichaam reactie (herziene12). Afhankelijk van de ernst van een belediging, cel het microglia signaal en werven extra typen naar de site van een schade. In het bijzonder de microglia activeren de astrocyten, die op zijn beurt fungeren als secundaire ontstekingscellen en vormen een dichte, beschermende barrière bevatten een letsel site13,14. Microglia kan ook een cascade van de activiteit in de cellen van de perifere immuunsysteem, die in de verdeling van de BBB resulteren kan zodat immuun infiltratie (herzien in verwijzing15) starten.
In het geval van apparaten de CNS ingeplant, weefselschade ten gevolge van het apparaat, alsmede de voortdurende aanwezigheid van de buitenlandse apparaat kan het starten van een proces genoemd gliale littekens. In dit proces, de microglia migreren naar en verspreiden op de site van letsel. Ze zijn ook starten met de release van inflammatoire factoren te neutraliseren van potentiële bedreigingen en werven extra gliacellen. Vervolgens geactiveerd astrocyten hypertrofische geworden en beginnen encapsulating het geïmplanteerde apparaat om te vormen van een continu vezelig barrière-16. Inflammatoire signalering dient ook om intrekking van neuronale processen uit de omgeving van het implantaat en uiteindelijk werft fibroblasten ter versterking van de ontwikkelingslanden gliale litteken17. De oligodendrocyten, verantwoordelijk voor de bescherming van de neuronen in de myeline te verbeteren geleidingsvermogen, dit proces niet overleven en verre cellen worden gepartitioneerd van het implantaat door de litteken-18. Gliale littekens sterk vermindert de functie en de levensduur van geïmplanteerde apparaten, met name voor opname elektroden, en uiteindelijk dient om de functionaliteit van neurale interfaces19te beperken.
Verschillende benaderingen hebben benut om de biocompatibiliteit en interface activiteit van geïmplanteerde apparaten in de CNS20,21,22,23te verhogen. Een uitgebreide review is beschikbaar op de biocompatibel ontwerp van deze neurale interfaces24. De meest prominente strategieën omvatten rondom de elektrode met compatibele coatings zoals polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glycolic zuur (PLGA)25, of verbetering van de elektrode met geleidende polymeren zoals poly (ethyleen dioxythiophene) (PEDOT), en polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioactieve coatings zijn ook tewerkgesteld aan aanwijzingen geven voor zenuwweefsel groei met behulp van liganden afgeleid van extracellulaire matrices met inbegrip van collagens, fibronectins en hyaluronic zuren32,33,34 ,35,,36,,37. De topicale van deze coatings is verder onderzocht met groeifactor release systemen te emuleren natuurlijke cel afscheidingen30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. gelijktijdig, sommige onderzoeksgroepen hebben gekozen om het remodelleren van de elektrode geometrie, flexibiliteit en compositie aan het verlagen van de mechanische wanverhouding tussen apparaat en weefsel51,52,53 ,54,55,56,,57. Over het geheel genomen hebben deze strategieën geleid tot veel veelbelovende verbeteringen in volgende generatie neurale Interfaciale apparaten, maar de lange termijn compatibiliteit een probleem gaande is en vooruitgang kan worden belemmerd door de complexe en tijdrovende in vivo modellen .
Dierlijke modellen gebaseerde benaderingen kunnen beperken de experimentele doorvoer en hogere kosten van de elektrode biocompatibiliteit testen. In vitro benadert met behulp van conventionele celcultuur technieken bieden een meer kosteneffectief alternatief maar niet veel van de complexiteit van de interactie tussen apparaat en weefsel58recapituleren. In het bijzonder, testen van oppervlaktecoatings 2D cel cultuur grenzen met het modelleren van de meetkunde van de elektrode en de invloed van mechanische mismatch en micromotion dacht dat bijdragen aan het genereren van een reactie van de gastheer bij te dragen tot apparaat mislukking59 , 60.
Om te overwinnen problemen in verband met 2D celcultuur, zijn hydrogel culturen van neurale cellen ontwikkeld voor een breed scala aan toepassingen, farmacologische studies61, directe neurale cel differentiatie62, om te begrijpen van de ziekte trajecten63,64, of gelaagde in co-cultuur met andere celtypes model cel migratie, neuroprotectie, of tot en met model weefsel microenvironments61. Hydrogels gemakkelijk worden gevormd in verschillende maten en geometrieën talrijke soorten primaire of vereeuwigd celculturen kunnen opnemen, en zijn zeer vatbaar voor analyse door veelgebruikte technieken zoals confocal fluorescentie microscopie. Als u wilt maken een model van het gliale littekens proces, hebben we onlangs ontwikkeld en een hyaluronzuur gebaseerde 3D hydrogel systeem voor high-throughput testen van de gliale reactie op geïmplanteerde elektroden (Figuur 1)65gekenmerkt. Dit systeem heeft een aantal duidelijke voordelen: 1) primaire gliale cellen (microglia astrocyten en oligodendrocyten) zijn ingekapseld in een 3D matrix samengesteld van polymeren van hyaluronzuur, een onderdeel van de endogene extracellulaire matrix; 2) de stijfheid van de matrix kan worden ‘afgestemd’ herstellen van de mechanische eigenschappen van hersenen of ruggenmerg weefsel; en 3) cellen kunnen worden samengevat in de matrix in een snelle aanpak van de Bank-top photopolymerization met groen licht, beperking van toxiciteit tijdens inkapseling. Dit systeem maakt zeer belangrijke eigenschappen van in vivo biocompatibiliteit: apparaten worden ingevoegd in de hydrogel op een vergelijkbare wijze aan weefsel, en de cellulaire reactie op geïmplanteerde apparaten op een groot aantal parameters65worden gecontroleerd. Het gaat hierbij om mechanische wanverhouding tussen apparaten en de hydrogel coatings van verschillende structuren en elektrische stimulatie pulsen. Dit systeem omvat ook Oligodendrocyt en verwante precursoren, die vaak aanwezig en aangeworven gliale littekens. Hun schade, dood en fagocytose door microglia zijn zeer indicatief van inflammatoire letsel en als een model verminderd littekens of herstel, zij hebben de capaciteit om aan te tonen van re-myelinisering van neuronen66.
Hierin beschrijven we een methode voor de synthese en de vorming van hybride hyaluronzuur hydrogels gecombineerd met verkrijgbare kelder membraan formuleringen te verbeteren van de opneming van de cel. Verder zullen we laten zien de opneming van primaire gekweekte gliale cellen (microglia astrocyten en oligodendrocyten) en analyse van de groei van de cultuur met immunocytochemie en confocale microscopie.
Richting van het doel van het genereren van een 3D cultuur systeem model gliale bioreactivity en het gliale littekens proces, hebben we een systeem dat kan ondersteunen primaire gekweekte microglia, astrocyten en oligodendrocyten en maakt robuuste karakterisering van cel morfologie en cel interacties. Van de microfoto komt te staan, was de morfologie van elk celtype duidelijk verschillend met 2D, 3D-HAMA en 3D HAMA-basale lamina mengsel platforms. In de 2D systeem, morfologie was duidelijk bevooroordeeld langs het vliegt…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de NSERC, CFI, AIHS, Alberta gezondheidsdiensten en de Davey Endowment for hersenonderzoek.
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |