Este trabalho apresenta um método que envolve a síntese e caracterização de micelas de amphiphile peptídeo monócito-direcionamento e o correspondente ensaios para testar a capacidade do micelle para vincular a monócitos e biocompatibilidade.
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Artigo de método
Síntese de monócitos-direcionamento do Peptide Amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose
Neste artigo
Resumo
Resumo
A aterosclerose é dos principais contribuintes para doenças cardiovasculares, a principal causa de morte no mundo, que reivindica a 17,3 milhões de vidas anualmente. A aterosclerose é também a principal causa de morte súbita e infarto do miocárdio, instigada por placas instáveis que se romper e obstruir o vaso sanguíneo sem aviso. Corrente de imagens modalidades não pode diferenciar entre placas estáveis e instáveis que se romper. Micelas de amphiphiles peptídeo (PAMs) podem superar esta desvantagem, como eles podem ser modificados com uma variedade de direcionamento metades que ligam especificamente ao tecido doente. Os monócitos foram mostrados para ser marcadores início da aterosclerose, enquanto grande acúmulo de monócitos é associado com placas propensas a ruptura. Daí, nanopartículas que podem direcionar os monócitos podem ser usadas para discriminar os diferentes estágios da aterosclerose. Para esse fim, descrevemos aqui, um protocolo para a preparação de monócitos-direcionamento PAMs (monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs self são montadas através de síntese em condições suaves a forma nanopartículas de 15 nm de diâmetro, com perto de carga de superfície neutra. In vitro, PAMs foram encontradas para ser biocompatível e tinha uma afinidade de ligação de alta para os monócitos. Os métodos descritos neste documento são promissores para uma ampla gama de aplicações em aterosclerose, bem como outras doenças inflamatórias.
Introdução
As doenças cardiovasculares continuam a ser as principais causas de morte globalmente com aproximadamente 17,3 milhões de mortes em todo o mundo1. Doenças cardiovasculares são contribuídas por aterosclerose, uma condição em que acumulam placas nas artérias, inibindo assim, sangue e fluxo de oxigênio para as células do corpo2,3. A progressão da aterosclerose envolve o espessamento e endurecimento das artérias por uma resposta inflamatória, metabolismo lipídico irregular e acúmulo de placa bacteriana, levando a placa ruptura e infarto do miocárdio,4,
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Protocolo
Nota: Leia o MSDS para reagentes e siga todas as medidas de segurança química, conforme exigido pela instituição local.
1. preparação de MCP-1 PAMs
-
Preparação de peptídeo de MCP-1
- Pesar 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang em uma embarcação da reação (RV). Enxágue o lado do VD com 5 mL dimethylforamide (DMF) em uma coifa de química.
- Carrega o RV em um sintetizador de peptídeo de bancada automatizada. Frascos de aminoácido de carga pré-embalados, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', do C a N-terminal. Incluem um frasco vazio no final para a etapa final de desproteção.
Nota: Um peptide mexido c....
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Resultados
Preparação de MCP-1 PAM
O CCR2-motivo (resíduos 13-35) da proteína de MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou mexido peptídeo [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] foi modificado com a adição de um resíduo de cisteína na N-terminal. O peptídeo de MCP-1 foi sintetizado por um método de fase sólida Fmoc-negociada usando um sintetizador de peptídeo automatizado. O peptídeo bruto foi purificado por HPLC de fase reversa em uma coluna de C8 a 50 ° C, utilizando 0,1% TFA em misturas acetonitri.......
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Discussão
MCP-1 PAMs são uma promissora plataforma de imagem molecular, consistindo de um peptídeo alvo hidrofílico e cauda hidrofóbica que impulsiona a natureza Self montada das nanopartículas. Este micelle monócito-direcionamento pode ser preparado por síntese simples e etapas de purificação de peptídeo de MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs têm muitas características benéficas na vivo imagem molecular tais como seus auto-montagem sob condições suaves, biodegradabilidade intrínseca e diversidade estrutural e química, pe.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer o apoio financeiro da University of Southern California, o coração nacional, pulmão e Instituto de sangue (NHLBI), R00HL124279, Eli e Edythe amplo Innovation Award e o L.K. Whittier Fundação Non-câncer Prêmio de pesquisa translacional concedida a EJC. Os autores agradecer o centro de microscopia eletrônica e microanálise, centro de excelência em NanoBiophysics, centro de excelência para a caracterização Molecular e Translational Imaging Center na Universidade de Southern California para assistência em configurações de instrumentais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-etanodital | VWR | E0032 | para síntese de peptídeos |
| 10 mL pipetas serológicas descartáveis | VWR | 89130-898 | para cultura de células |
| tubos de centrífuga de 15 mL, polipropileno | VWR | 89401-566 | para várias aplicações |
| Ácido 2,5-di-hidroxibenzóico, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | para MALDI |
| 25 mL descartável pipetas serológicas | VWR | 89130-900 | para cultura de células |
| 2-mercaptoetanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | para cultura de células |
| 5 mL pipetas serológicas descartáveis | VWR | 89130-896 | para cultura de células |
| tubos de centrífuga de 50 mL | VWR | 89039-658 | para várias aplicações |
| Balão de cultura de 75 cm2 | Fisher Scientific | 13-680-65 | para cultura de células |
| 75 mL de vaso de reação | Protein Technologies | 3000005 | para síntese de peptídeos |
| Placa de cultura de células de 96 poços | VWR | 40101-346 | para ensaio MTS |
| Acetonitrila, grau HPLC | Fisher Scientific | A998SK-4 | para purificação por HPLC |
| Vidro de borossilicato, 1 dram | VWR | 66011-041 | para síntese de PAM |
| Pipeta de vidro borosicado, pontas compridas | VWR | 14673-043 | para várias aplicações |
| Lamínula, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | para microscopia |
| confocal Cy5 amina | Abcam | ab146463 | para conjugação peptídica |
| Éter dietílico, grau ACS | Fisher Scientific | E138-1 | para precipitação peptídica |
| Descartável seringas, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | para purificação de HPLC |
| Duplo hemocitômetro neubauer governado | VWR | 63510-13 | para contagem |
| de células DSPE-PEG (2000) amina | Avanti | 880128P | para conjugação de peptídeos |
| DSPE-PEG (2000) maleimida | Avanti | 880126P | para conjugação de peptídeos |
| DSPE-PEG (2000) -NHS éster | Nanocs | PG2-DSNS-10K | para conjugação com Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle médio-alto glicose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | para cultura de células |
| Soro fetal bovino, qualificado, inativado por calor | ThermoFisher Scientific | 10438026 | para cultura de células |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | para síntese de peptídeos |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | para síntese de peptídeos |
| Resina Fmoc-Lys(Boc)-wang, malha 100-200 | 856013 Novabiochem | para síntese de peptídeos | |
| Ácido fórmico, ótimo grau LC/MS | Fisher Scientific | A117-50 | para purificação por HPLC |
| Glicerol | VWR | M152-1L | para microscopia confocal |
| Contador de contagem manual | Fisher Scientific | S90189 | para contagem de células |
| Barras de agitação magnéticas, VWR | 58949-006 | ovo para conjugação de peptídeos | |
| Metanol, certificado ACS | Fisher Scientific | A412-4 | para síntese de PAM |
| Kit de ensaio colorimétrico de proliferação celular MTS | VWR | 10191-104 | para ensaio MTS |
| N,N-Dimetilformamida, grau de sequenciamento | Fisher Scientific | BP1160-4 | para síntese de peptídeos |
| N-metilmorfolina | Protein Technologies | S-1L-NMM | para síntese de peptídeos |
| Paraformaldeído | Fisher Scientific | AC416780250 | para fixação de células |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | para várias aplicações |
| Penicilina/estreptomicina, 10.000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | para cultura de células |
| Vaso de síntese de peptídeos, 25 mL& nbsp; | Fisher Scientific | CG186011 | para síntese de peptídeos |
| Ácido fosfotúngstico | Fisher Scientific | A248-25 | para TEM |
| Espectro de Piperidina | P1146-2.5LTGL | para síntese de peptídeos | |
| Lâmina de microscópio de vidro simples 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | para microscopia confocal |
| Reservatórios de reagentes, estéreis | VWR | 95128093 | para cultura de células |
| Pinça de fechamento automático | TedPella | 515 | para TEM |
| Filme de suporte TEM | TedPella | 01814F | para TEM |
| Ácido trifluoroacético | Fisher Scientific | BP618-500 | para clivagem de peptídeos e purificação por HPLC |
| Triisopropilsilano | VWR | TCT1533-5ml | para clivagem de peptídeos |
| Solução de azul de tripano, 0,4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | para contagem de células |
| Pinça, serrilhada de uso geral | VWR | 231-SA-SE | para microscopia confocal |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | monócito murino |
| automatizado sintetizador de peptídeos de bancada | Protein Technologies | PS3 Sintetizador de peptídeos de bancada | |
| &alfa; - ciano- 4- ácido hidroxicinâmico, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | para MALDI |
Referências
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12....
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Reimpressões e permissões
