Synthèse de ciblage de Monocyte Peptide Amphiphile Micelles pour l’imagerie de l’athérosclérose
Summary
Cet article présente une méthode impliquant la synthèse et la caractérisation de monocyte-ciblage des micelles peptide amphiphile et le correspondant d’essais pour tester la biocompatibilité et la capacité de la micelle de liaison aux monocytes.
Abstract
L’athérosclérose est un facteur majeur de maladies cardio-vasculaires, la principale cause de décès dans le monde, que réclame 17,3 millions de vies chaque année. L’athérosclérose est également la principale cause de mort subite et infarctus du myocarde, fomentées par des plaques instables qui se rompent et bloquer le vaisseau sanguin sans avertissement. Courant de modalités d’imagerie ne peut pas différencier entre les plaques stables et instables qui se rompent. Micelles de peptides amphiphiles (PAMs) peuvent surmonter cet inconvénient car ils peuvent être modifiés avec une variété de ciblage des moitiés qui se lient spécifiquement à des tissus malades. Monocytes montrent à des marqueurs précoces de l’athérosclérose, tandis que la forte accumulation de monocytes est associée à plaques sujettes à la rupture. Par conséquent, des nanoparticules qui peuvent cibler des monocytes peuvent servir à discriminer les différentes étapes de l’athérosclérose. À cette fin, nous décrivons ici un protocole pour la préparation de monocyte-ciblage PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sont self-assembled par l’intermédiaire de synthèse dans des conditions douces aux nanoparticules forme de 15 nm de diamètre, avec près de charge surface neutre. In vitro, PAMs se sont avérées biocompatibles et avait une affinité élevée pour les monocytes. Les méthodes décrites dans les présentes sont prometteuses pour un large éventail d’applications dans l’athérosclérose ainsi que d’autres maladies inflammatoires.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires restent les principales causes de décès dans le monde avec environ 17,3 millions de décès dans le monde1. Les maladies cardiovasculaires sont fournis par l’athérosclérose, une affection dans laquelle les plaques s’accumuler dans les artères, le sang ainsi inhiber et le débit d’oxygène aux cellules du corps2,3. La progression de l’athérosclérose implique l’épaississement et le durcissement des artères par une réaction inflammatoire, métabolisme lipidique irréguliers et la formation de plaques, conduisant à la plaque risque de rupture ou d’infarctus du myocarde,4,5. Les cellules endothéliales expriment des molécules de cytokines et d’adhérence, incluent des MCP-1 qui se lie au récepteur des chimiokines C-C (CCR2) à la surface des monocytes6,7,8. Cholestérol oxydé convertit monocytes macrophages durant les premiers stades de formation de la plaque, qui amplifie la réponse inflammatoire dans la région et conduit à la lésion des tissus et la formation de plaques instables ou vulnérables9, 10.
Traditionnellement, l’athérosclérose est évaluée en évaluant la sténose luminale par imagerie anatomique à l’aide d’ultrasons ou angiographie11,12. Cependant, ces méthodes ne peuvent déterminer un rétrécissement sévère de la paroi artérielle et pas le stade précoce de l’athérosclérose, car la croissance initiale plaque entraîne un remodelage artériel maintenir la taille de l’artère et le sang écoulement tarifaire12,13, 14. Par conséquent, les angiogrammes sous-représenter la prévalence de l’athérosclérose. En outre, les techniques d’imagerie non invasives comme une émission de photon unique calculé tomographie, tomographie par émission de positons et l’imagerie par résonance magnétique ont récemment été utilisées pour caractériser la morphologie de la plaque car ils peuvent fournir des détails initiaux et caractérisation des plaques. Toutefois, ces modalités sont souvent limitées par le manque de sensibilité, résolution spatiale, ou exigent l’utilisation de rayonnements ionisants, rendant la progression plaque d’imagerie à des stades différents, beaucoup plus difficile de15,16, 17. Un système d’imagerie permettant d’identifier plus précisément les plaques à différents stades de l’athérosclérose reste à développer.
NANOPARTICULES ont montré pour être une plate-forme émergente pour in vivo plaque ciblage et diagnostics18,19,20,21. En particulier, PAMs sont avantageuse en raison de leur diversité chimique et de la capacité d’accueillir une variété de moitiés, compositions, tailles, formes et fonctionnalisation de surface22. Peptides amphiphiles (Fe) se composent d’un peptide « tête hydrophile, » attaché à une queue hydrophobe, qui sont généralement des lipides ; Cette structure amphiphile confère des capacités de l’auto-assemblage et permet un affichage multivalent des peptides sur la surface des particules22,23,24. Le peptide polaires peuvent influer sur la forme des particules par le biais de pliage et de liaisons hydrogènes entre les peptides25. Les peptides qui se replient grâce à l’interaction de feuillet β auraient dû être divulgués afin de former des micelles allongés, tandis que α-hélicoïdale confirmation peut former deux micelles sphériques et allongée22,23,24, 25,26,27. Linkers de polyéthylène glycol (PEG) qui protègent la charge superficielle du peptide peuvent être placés entre le peptidiques hydrophiles et la queue hydrophobe de PAMs, améliorer l’accessibilité de la NANOPARTICULE dans la circulation systémique28, 29 , 30 , 31. PAMs sont aussi avantageuses car elles sont biocompatibles et auraient dû être divulgués d’avoir un large éventail d’applications32,,33. Solubilité dans l’eau des micelles offre un avantage sur les autres systèmes à base de nanoparticules comme certaines nanoparticules polymériques qui ne sont pas solubles dans l’eau et ont dû être suspendu en solubilisants pour injections34. En outre, la possibilité de créer des PAMs qui démonter en réponse à un stimulus spécifique fait PAMs un candidat attrayant pour drogue intracellulaire contrôlée livraison35.
En se liant au récepteur CCR2 et qui s’accumulent dans la crosse aortique, PAMs ont été développées précédemment monocyte visant à surveiller les différents stades de lésions athéroscléreuses dans l’ aorte9. Chez les souris– / – de l’ApoE, accumulation de monocytes augmente proportionnellement à la plaque progression36. En outre, il a été constaté que les patients avec des plaques sujettes à rupture, stades contiennent des quantités plus élevées de monocytes37. Par conséquent, la modification des PAMs d’incorporer des MCP-1 est utile car il permet une plus grande précision de ciblage et de différencier les lésions athéroscléreuses et fin-début. Ces études de validation a également vérifié que PAMs sont suffisamment sûres pour être utilisé en préclinique et sont effacées insuffisants38. Monocytes et l’inflammation étant caractéristique à d’autres maladies, MCP-1 PAMs ont le potentiel d’être utilisé pour des applications thérapeutiques et diagnostiques dans d’autres maladies au-delà de l’athérosclérose8,39,40 , 41.
Ici, nous rapportons la fabrication de hautement évolutif et auto-assemblés PAMs de MCP-1 qui fait preuve de la particule taille optimale, charge superficielle et ciblage sélectif aux monocytes pour des applications d’imagerie dans l’athérosclérose.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCP-1 PAMs sont une plate-forme d’imagerie moléculaire prometteuse, consistant en un peptide ciblage hydrophile et queue hydrophobe qui anime la nature auto-assemblées de la NANOPARTICULE. Ce ciblage monocyte micelle peut être préparé par synthèse simple et étapes de la purification du peptide de MCP-1 et DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs ont de nombreuses caractéristiques bénéfiques en vivo imagerie moléculaire telles que leur auto-assemblage sous des conditions douces, biodégradabilité intrinsèque et…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner l’appui financier de l’University of Southern California, le National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli et Edythe large Innovation Award et la Fondation de Whittier L.K. Non-Cancer Bourse de recherche translationnelle accordée à EJC. Les auteurs remercient le Centre pour la microscopie électronique et microanalyse, Centre d’Excellence en NanoBiophysics, Centre d’Excellence pour la caractérisation moléculaire et translationnelle Imaging Center à l’University of Southern California, de l’assistance configurations instrumentales.
Materials
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
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