Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

Summary

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Abstract

T 림프 톨 급속 하 고, 편광 신호에 종사 하는 TCR 활성화 다음 분 이내 발생. 이 면역 시 냅 스, T 세포 활성화를 조절 하 고 이펙터 응답을 대상으로 하는 진부한 셀 교차로의 형성을 유도 합니다. 이러한 프로세스를 효과적으로 공부 하기 빠르고, 편광 응답 캡처에 맞춤화 된 이미징 접근 필요 하다. 이 프로토콜 기반으로 photoactivatable 펩 티 드-주요 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)는 자외선에 노출 될 때까지 비 물질로 이러한 시스템을 설명 합니다. Videomicroscopy 실험 동안 타겟 decaging이 시 약의 TCR 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 및 고해상도 이미징 총 내부 반사 (TIRF) 이후 세포 응답의 모니터링 수 있습니다. 이 방법은 또한 유전과 약리 섭 동 전략와 호환 됩니다. 면역학 시 냅 스의 기반이 되는 편광 cytoskeletal 구조의 형성에 TCR 신호를 연결 하는 잘 정의 된 분자 통로의 어셈블리에 대 한 수 있습니다.

Introduction

T 림프 톨 (T 세포) 항 원 펩 티 드의 세포 표면 MHC 컨텍스트에서 표시를 인식 하 여 세포 면역에 중심 역할을 재생 합니다. TCR에 의해 중재 되는 항 원 인식, naïve T 세포의 분화를 구동 하 고 이펙터 인구에 의해 cytolytic와 의사 소통 응답의 납품을 촉진. TCR 참여는 또한 세포질 구조에 극적인 변화를 유도 한다. 분 이내에, T 세포 면역학 시 냅 스 (IS)^1,2로 알려진 편광된 인터페이스를 형성 하는 항 원 제시 세포 (APC)의 측에 gloms. IS cytokines의, 또는 세포 독성 T 세포 (Ctl), 송출 파괴 용균성 단백질의 경우 방향 릴리스를 사용 하 여 T 세포 효과 기 응답을 potentiates.

PMHC에 의해 TCR 참여 활성화의 T 세포 (위도), 궁극적으로 시 냅 스 골격²의 강력한 리 모델링 추진에 대 한 링커를 포함 한 여러 다운스트림 어댑터 분자의 급속 한 인 산화를 유도 한다. 대뇌 피 질의 filamentous 말라 (F-말라) T 세포 APC 표면 확산을 다음 IS 주변 및 중앙에서 고갈에 F-말라 축적으로 특징 고리 모양의 구조를 확인 한다. F-말라 반지 형성 인터페이스의 중심 바로 아래 위치에 microtubule 조직 센터 (MTOC, T 세포에서는 centrosome 라고도)의 재교육에 밀접 하 게 결합 이다. 두 이벤트는 초기 항 원 인식의 분 이내 발생 하 고 후속 활성화 이벤트와 이펙터 응답 발생 건축 컨텍스트 설정.

공부 하 고는 형성, 다양 한 실험실 접근 송출 고정된 TCR ligands를 포함 하거나 지원 자체 ligands^3,4를 포함 하는 지질 bilayer 유리 표면에 의해 대체 됩니다 개발 했습니다. T 세포는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRF) 또는 confocal 현미경 검사 법, 초기 T 세포 활성화 및 IS 형성의 고해상도 연구를 활성화 하 여 몇 군데 수 있습니다이 표면에 IS 같은 연락처를 형성 합니다.

하지만이 방법을 완벽 하 게 조립된 IS의 뛰어난 시각화에 대 한 허용, 신호 다음 TCR:pMHC 결 찰의 많은 초 이내에, TCR 활성화를 정확 하 게 다음 사건의 순서를 결정 하는 노력을 복잡 하 게 발생 . 이 문제를 우회 하는 photoactivation 방식 개발 되었습니다, TCR 활성화^5,,67의 spatiotemporal 제어를 달성 하기 위해 사용 되는 photoactivatable pMHC. 이 시스템에서 T 세포는 비 물질로 TCR까지 자외선 (UV)을 조사 하는 photoactivatable pMHC를 포함 하는 유리 표면에 부착 됩니다. UV 방사선의 T 세포 아래 표면 미크론 크기의 지역 T 세포에 의해 인식 될 수 있는 물질로 영역을 만드는 photocage를 제거 합니다. 이후 신호 이벤트와 cytoskeletal 개장 다음 유전자 인코딩된 형광 기자를 사용 하 여 모니터링 됩니다. 항 원 펩 티 드, 엄 시 토 크롬 c_88-103 (MCC)와 ovalbumin_257-264 (OVA), 선물 된다 II MHC-E^k 클래스와 클래스의 맥락에서 나 MHC H2-K^b, 각각의 2 개의 photoactivatable 버전 되었습니다 (그림 1)를 개발 했다. 그러면 두 CD4의 분석⁺ T 세포 (표현 5 C. 고객 센터-난-E^k 에 대 한 특정 C7, 2B4, 또는 모양과 TCRs)와 CD8⁺ T 세포 OVA-H2-K^b (OT1 TCR 표현)에 대 한 특정.

지난 10 년간, TCR photoactivation 및 이미징 접근은 이용 되어 신호 단계 초기 TCR의 정확한 활동을 설정 하 고 또한 편광된 cytoskeletal 개장^5, 를 경 세 하는 분자 경로 식별 하 ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10}. 예를 들어 분석 결과 그 centrosome 결정에서 쓸모 있었다 송출 쪽으로 재교육 가운데는 IS에 지질 두 번째 메신저 diacylglycerol의 지역화 된 그라데이션에 의해 중재입니다. 이 방법론의 T 세포 기능 고해상도 이미징 분석을 요구 하는 응용 프로그램에 대 한 가치가 있을 나갈 것입니다 예상 된다.

Protocol

1입니다. 물질로 유리 표면 준비 Biotinylated 폴 리-L-리 신 (바이오-PLL)와 코트 8 잘 연 발 coverglass 희석 증류수, 이온을 제거 된 물 (ddH2O) 1: 500. 실 온 (RT)에서 30 분 동안 품 어. H2o. 세척 실시간에서 2 시간 건조 블록 바이오-PLL 실시간에서 30 분 동안 차단 버퍼 (HEPES 버퍼링 염 분 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], 2 %BSA)와 표면 코팅 폴 리-L-리 신 hydrobromide 10mm …

Representative Results

Photoactivation 및 이미징 접근 관찰과 급속 하 고, 편광 신호 응답의 손쉬운 정량화 할 수 있습니다. 복제의 기능을 설명 하기 위해 여기 TCR 유도 DAG 축적과 centrosome 재교육 사이 spatiotemporal 상관 관계를 조사 하는 실험 이다. 5 C. C7 T 셀 폭발 했다 2 명의 형광 기자 불리고 retrovirally: 단백질 키 니 아 제 C θ에서에서 탠덤 C1 도메인 포함 된 DAG 바이오 센서는 centrosome 모니터링 GFP (…

Discussion

최근 몇 년 동안, 라이트는 세포질 과정의 spatiotemporally 제어 활성화를 위한 훌륭한 도구로 떠오르고 있다. 다양 한 방법론 개발 되었습니다, 각각 관련 장점과 단점. 고정, extracellular ligands의 decaging에, 기반으로, 여기에 설명 된 시스템은 급속 한, subcellular, 편광 신호 응답의 분석에 대 한 이상적으로 적합 합니다. 이 방법은 위에서 설명한 T 세포에는 대형 검사에 적용 되었습니다. 또한, 다른 수용 ?…

Materials

Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermofischer Scientific	155361
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit	Avidity	BirA500	Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK			For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody	BD Biosciences	553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	Anaspec		Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1			For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp	UVP	UVGL-25	Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system.	Olympus		Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragm	Andor
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