ニューラル ネットワークによる発達有能か無能なマウス完全育てられた卵母細胞の同定
Summary
ここでは、中期 II ステージに卵核胞から体外成熟中に実行される卵発達能力の非侵襲的評価するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、粒子画像流速測定法 (PIV) ニューラル ネットワーク解析とタイムラプス イメージングを組み合わせます。
Abstract
不妊クリニック発達有能と無能な卵全体の妊娠の結果を向上させる非侵襲的な手順を使用してを選択する機能の恩恵。我々 は最近、卵核胞 (GV) から体外成熟細胞運動の分析に続いて、中期 II ステージ中にマウス卵母細胞の顕微鏡のライブ観察に基づく分類方法を開発この時間経過の期間中に発生しています。ここでは、このプロシージャの詳細なプロトコルを提案する.卵は、完全育てられたから胞状卵胞から隔離され、37 ° C、5% CO2で時間経過の分析のため、顕微鏡内 15 時間培養します。写真は、8 分間隔で撮影されます。各卵子の培養期間中に発生する細胞質の運動速度 (CMVs) のプロファイルを計算する粒子画像流速測定法 (PIV) メソッドを使用して画像を分析します。最後に、それぞれの単一の卵母細胞の CMVs は主務が発達 91.03% の精度で無能か配偶子の確率を予測する数理分類ツール (フィード フォワード ニューラル ネットワーク、ファン) を介して供給されます。このプロトコルは、マウスの設定は、人間を含む他の種の卵母細胞に今テストでした。
Introduction
女性の不妊は、女性数の増加に影響を与える検査です。世界保健機関によると約カップルの 20% が不妊、女性不妊原因の 40% です。さらに、がん治療を受ける女性の 3 分の 1 (300,000/年、米国やイタリアで 30,000/年それぞれ) 早期の卵巣の失敗を開発。
がん患者の不妊を防ぐため戦略は、MII ステージ (GV-MII 切り替え) に GV 卵子の体外成熟 (IVM) 続いて、がん治療前に卵胞の凍結と分離です。受精と発生過程と全体的な妊娠成功1,2卵子の発生能の非侵襲的なマーカーの可用性が向上します。
ヘキスト 33342、觀螢光色素で染色後に観察されたクロマチン構成に基づいて完全育てられた卵母細胞が囲まれた核小体 (SN) やない囲まれた核小体 (NSN)3のいずれかに分類されます。異質染色質組織以外にも卵母細胞のこれらの 2 つのタイプ表示多く形態的, 機能的違い3,4,5,6,7,8 ,9, 減数分裂と発達能力を含みます。体外成熟および卵巣から分離されたとき両方が MII 期卵子に達するの入力精子受精後 2 細胞期に開発、用語9SN クロマチン組織にのみ発展するかもしれない。有能と無能な卵母細胞を選択するための分類法として良い, 主な欠点は螢光色素自体と、上記のすべての検出に使用される紫外線が細胞に突然変異誘起効果は。
これらすべての理由から、我々 は同じ高い分類精度を維持しながらヘキストの使用を置き換えることができます SN または NSN のクロマチン構造に関連付けられている他の非侵襲的なマーカーの検索。細胞質の運動速度 (CMVs) の時間経過の観察は、細胞状態の特徴的な機能として現れています。たとえば、最近の研究は、CMVs の間の関連付けは、受精の時間と能力をマウスとヒトの受精卵の着床前の完全なと完全な長期的開発10,11で記録を示した。
これらの以前の研究に基づいて、ここで述べたい発達有能か無能なマウス完全育てられた卵5,6,7,8の認識のためのプラットフォーム。プラットフォームは、3 つの主な手順に基づいて: 1) から胞状卵胞由来卵子は最初囲まれて核小体 (SN) またはない囲まれた核小体 (NSN); としてクロマチン構成いずれかに基づいて分類されます各単一卵子の GV の MII の移行中に発生した CMVs の 2) コマ撮り画像が撮影され、粒子画像流速測定法 (PIV); と分析・ 3) PIV による解析で、フィード フォワード人工ニューラル ネットワーク (ファン) ブラインド分類12,13。私たちは、テストおよび他の哺乳類種 (例えば牛、猿、人間) ために使用する利用可能な準備ができているし、マウス用に設計されたプロシージャの最も重要な手順の詳細を与えます。
Protocol
Representative Results
Discussion
1 つはこのプロトコル マウス卵母細胞と他の種のそれらの実行中の世話をする必要がありますいくつかの重要な手順があります。コンパニオンの積雲からの分離細胞のトリガーに卵母細胞必要がありますすぐに記録の低下に転送一度彼らの卵胞から分離、GV の MII 遷移の開始。議定書への可能な変更が Coc 分離に使われる M2 媒体に 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) の付加であります。IBM…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
サポートのおかげで可能に作られたこの作品: パヴィア大学ドイツ連邦共和国 2016;パルマ大学フィル 2014、2016;本研究の遂行に必要なプラスチック製品を供給するためのキネシス。博士シェーン ウィンザー (工学部、ブリストル大学、イギリス) は、Cell_PIV ソフトウェアを提供することを感謝いたします。
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
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