基于神经网络的发育能力或不称职小鼠全生长卵母细胞的识别
Summary
在这里, 我们提出了一个非侵入性评估的卵母细胞发育能力在他们的体外成熟从生发泡到中期 II 阶段。该方法将时间推移成像与粒子图像测速 (PIV) 和神经网络分析相结合。
Abstract
不孕诊所将受益于选择发育能力的vs不称职的卵母细胞使用非侵入性程序, 从而改善整体妊娠结局。我们最近开发了一种基于显微活体观察的小鼠卵母细胞在他们的体外成熟从胚泡 (问) 到中期 II 阶段, 然后分析的细胞质运动在这段时间内发生。在这里, 我们提出了这个程序的详细协议。卵母细胞从完全生长的窦卵泡中分离出来, 在15小时内培养为37摄氏度和 5% CO2的时间失效分析显微镜。图片以8分钟的间隔拍摄。利用粒子图像测速 (PIV) 方法对图像进行分析, 计算每个卵母细胞在整个培养期内的细胞质运动速度 (CMVs) 剖面。最后, 通过一个数学分类工具 (前馈人工神经网络, 文芳) 来喂养每个卵母细胞的 CMVs, 预测配子发育能力或不称职的概率, 精度为91.03%。该协议, 为鼠标设置, 现在可以测试其他物种的卵母细胞, 包括人类。
Introduction
女性不孕症是一种影响越来越多的妇女的病理学。根据世界卫生组织的数据, 大约20% 的夫妇是不孕, 40% 是由于女性不孕。此外, 在美国或意大利接受癌症治疗的妇女中, 有三人 (分别为30万年和3万岁) 发育过早卵巢衰竭。
预防癌症患者不孕症的策略是在肿瘤治疗前, 卵巢卵泡的分离和冷冻保存, 其次是 “体外” 成熟 (病媒) 在细胞产业部的阶段 (即对产业部的转变)。无创性的卵母细胞发育能力标志物的提供将改善受精和发育过程, 以及整个妊娠成功1,2。
根据 supravital fluorochrome 赫斯特33342的染色后观察到的染色质构型, 哺乳动物完全生长的卵母细胞被归类为被包围的核仁 (SN) 或未被包围的核仁 (诺基亚)3。除了不同的染色质组织, 这两种类型的卵母细胞显示许多形态学和功能差异3,4,5,6,7,8 ,9, 包括它们的减数分裂和发展能力。当从子房分离并成熟的体外时, 这两种卵母细胞都达到了产业部的阶段, 在精子受精后, 发展到2细胞阶段, 但只有有 SN 染色质组织的人才能发展到足月 9。虽然作为选择称职的vs不称职卵母细胞的分类方法是好的, 但主要的缺点是 fluorochrome 本身的诱变效应, 最重要的是用于其检测的紫外线光可能存在于细胞上。
由于所有这些原因, 我们寻找其他与 SN 或诺基亚的染色质构象相关的非侵入性标记, 可以替代赫斯特的使用, 同时保持相同的高分类精度。胞质运动速度 (CMVs) 的时间推移观察是细胞状态的一个显著特征。例如, 最近的研究表明, 在受精时记录的 CMVs 与小鼠和人类受精卵完成植入前和足月发育的能力之间的联系10,11。
基于这些早期的研究, 我们这里描述一个平台, 以识别发育能力或不称职的老鼠完全生长的卵母细胞5,6,7,8。该平台基于三主要步骤: 1) 从窦卵泡分离出的卵母细胞首先根据其染色质构型分类, 无论是被包围的核仁 (SN) 或未被包围的核仁 (诺基亚);2) 采用粒子图像测速仪 (PIV) 对各单卵母细胞的 CMVs 时间推移图像进行分析;3) 通过对盲分类12、13的前馈人工神经网络 (文芳), 分析了 PIV 获得的数据。我们详细介绍了为鼠标准备的程序中最关键的步骤, 使其可供测试并用于其他哺乳动物物种 (例如,牛、猴和人类)。
Protocol
Representative Results
Discussion
有几个关键步骤, 你应该照顾, 同时执行此协议与鼠标卵母细胞以及其他物种。一旦从卵泡中分离出来, 卵母细胞就应该立即转移到记录滴中, 因为与伴卵丘细胞的分离触发了对产业转移的开始。对本议定书可能的修改可能是将 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX) 添加到用于 COCs 隔离的 M2 介质中。IBMX 防止了即时触发的问-产业转移, 并允许同步的整个实验组的卵母细胞。
在我们的实验?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作使成为可能多亏了支持: 帕维亚大学悬浮角速度陀螺仪 2016;帕尔马大学 2014, 2016;并运动提供必要的 plasticware 进行这项研究。我们感谢夏恩温莎博士 (英国布里斯托尔大学工程学院) 提供 Cell_PIV 软件。
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
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