En neurale netværk-baseret identifikation af udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente mus fuldt udvokset oocyter
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for non-invasiv vurdering af oocyt udviklingsmæssige kompetence udført under deres i vitro modning fra den germinale vesikel metafase II scenen. Denne metode kombinerer time-lapse imaging med partikel billede Velocimetri (PIV) og neurale netværk analyse.
Abstract
Infertilitet klinikker ville drage fordel af muligheden for at vælge udviklingshæmmede kompetente vs inkompetente oocyter ved hjælp af ikke-invasive procedurer, dermed forbedre det samlede graviditet resultatet. Vi har for nylig udviklet en klassificeringsmetode baseret på mikroskopiske levende observationer af musen oocyter under deres i vitro modning fra den germinale vesikel (GV) metafase II scenen, efterfulgt af en analyse af cytoplasmatisk bevægelser forekommende i denne time-lapse periode. Vi præsenterer her, detaljerede protokoller af denne procedure. Oocytter er isoleret fra fuldt udvokset antral follikler og kulturperler for 15 h inde i et mikroskop udstyret for time-lapse analyse ved 37 ° C og 5% CO2. Billederne er taget med 8 min. mellemrum. Billederne er analyseret ved hjælp af metoden partikel billede Velocimetri (PIV), der beregnes for hver oocyt profil af cytoplasmatisk bevægelse hastigheder (CMVs) forekommer i hele perioden kultur. Endelig, CMVs af hver enkelt oocyt fodres gennem en matematisk klassificering værktøj (Feed-forward kunstige neurale netværk, FANN), der forudsiger sandsynligheden for en gamet udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente med en nøjagtighed på 91.03%. Denne protokol, sat op til musen, kan nu blive testet på oocytter af andre arter, herunder mennesker.
Introduction
Kvindelig infertilitet er en patologi, som berører et stigende antal kvinder. Ifølge World Health Organization er omkring 20% af parrene ufrugtbar, med en 40% på grund af kvindelig infertilitet. Desuden er en tredjedel af kvinder, der gennemgår kræftbehandling (300.000 pr. år og 30.000 pr. år i USA eller Italien, henholdsvis) udvikle tidligt ovariesvigt.
En strategi til forebyggelse af barnløshed hos kræftpatienter er isoleret og kryopræservering af ovariefollikler før onkologisk behandling, efterfulgt af in vitro- modning (IVM) af GV oocyter MII fase (GV at MII overgang). Tilgængeligheden af non-invasiv markører for oocyt udviklingsmæssige kompetence ville forbedre befrugtningen og udviklingsprocesser og den samlede graviditet succes1,2.
Baseret på deres kromatin konfiguration observeret efter farvning med den supravital fluorokrom Hoechst 33342, pattedyr fuldt udvokset oocyter klassificeres enten som en omgivet Nucleolus (SN) eller en ikke omgivet Nucleolus (NSN)3. Udover deres forskellige kromatin organisation vise disse to typer af oocytter mange morfologiske og funktionelle forskelle3,4,5,6,7,8 ,9, herunder deres meiotiske og udviklingsmæssige kompetence. Når isoleret fra æggestokken og modnet i vitro, begge type oocyter reach MII fase, og efter sæd insemination, udvikle til de 2-celle stadium, men kun dem med en SN kromatin organisation kan udvikle sig til begrebet9. Selvom god som en klassificeringsmetode for at vælge kompetente vs inkompetente oocytter, er den største ulempe de mutagene virkning, som fluorokrom, sig selv og først og fremmest UV-lys bruges til dens afsløring kan have på cellerne.
Af alle disse grunde søgte vi efter andre non-invasiv datamærker forbundet med SN eller NSN kromatin kropsbygning som kunne erstatte brugen af Hoechst samtidig opretholde samme høje klassificering nøjagtighed. Time-lapse observation af cytoplasmatisk bevægelse hastigheder (CMVs) fremstår som en funktion karakteristiske celle status. Nylige undersøgelser påviste f.eks, association mellem CMVs registreres på tidspunktet for befrugtning og kapacitet af mus og menneskelig zygotes til komplet præimplantationsdiagnostik og fuldbårne udvikling10,11.
Baseret på disse tidligere undersøgelser, beskriver vi her en platform for anerkendelse af udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente mus fuldt udvokset oocyter5,6,7,8. Platformen er baseret på tre vigtigste skridt: 1) oocyter isoleret fra antral follikler er først klassificeret baseret på deres kromatin konfiguration enten som en omgivet nucleolus (SN) eller en ikke-omgivet nucleolus (NSN); 2) time-Lapse billeder af CMVs opstår under GV at MII overgangen af hver enkelt oocyt er taget og analyseret med partikel billede Velocimetri (PIV); og 3) oplysninger indhentet med PIV analyseres med en Feed-forward kunstige neurale netværk (FANN) for blinde klassificering12,13. Vi give nærmere oplysninger om de mest kritiske trin i den procedure, der er designet til musen til at gøre det klar tilgængelige til at blive testet og bruges til andre pattedyr arter (fx kvæg, abe og mennesker).
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere vigtige skridt man skal tage sig af mens de udfører denne protokol med musen oocytter, samt de af andre arter. Når isoleret fra deres follikler, oocyter bør være umiddelbart overføres til optagelse dråber, som adskillelsen fra følgesvend cumulus celler udløsere i begyndelsen af GV at MII overgangen. En eventuel ændring af denne protokol kunne være tilsætning af 3-isobutylmethacrylat-1-Methylxanthin (IBMX) til M2 medium anvendes til p-piller isolation. IBMX forhindrer omgående udløsning af GV at …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev gjort mulig takket være støtte af: universitetet i Pavia FRG 2016; Universitetet i Parma FIL 2014 2016; og Kinesis for at levere plasticware nødvendigt at gennemføre denne undersøgelse. Vi takker Dr. Shane Windsor (Fakultet, University of Bristol, UK) for at give Cell_PIV software.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
