Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die nicht-invasive Beurteilung der Eizelle Entwicklungskompetenz während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle zur Metaphase II Stufe durchgeführt. Diese Methode verbindet Zeitraffer Bildgebung mit Particle Image Velocimetry (PIV) und neuronale Netzwerkanalysen.
Abstract
Die Möglichkeit, entwicklungsgeschichtlich zuständigen vs. inkompetent Eizellen mit nicht-invasiven Verfahren, so verbessert das Gesamtergebnis der Schwangerschaft wählen würde Unfruchtbarkeit Kliniken profitieren. Wir vor kurzem entwickelt eine Klassifizierungsmethode basierend auf mikroskopische live Beobachtungen der Maus Eizellen während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle (GV) die Metaphase II Stufe, gefolgt von der Analyse der zytoplasmatischen Bewegungen in diesem Zeitraffer Zeitraum auftreten. Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle dieses Verfahrens. Eizellen sind von ausgewachsenen antrale Follikel isoliert und kultiviert für 15 h in einem Mikroskop für Zeitraffer-Analyse bei 37 ° C und 5 % CO2ausgestattet. In 8 min Abständen fotografiert. Die Bilder werden analysiert, mit der Particle Image Velocimetry (PIV)-Methode, die für jede Eizelle, das Profil der zytoplasmatischen Bewegung Geschwindigkeiten (CMVs) während der gesamten Kultur vorkommende berechnet. Schließlich werden die CMVs jede einzelne Eizelle durch eine mathematische Klassifizierungs-Tool (Feed-Forward künstliche neuronale Netz, FANN) zugeführt, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Gamete entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent mit einer Genauigkeit von 91,03 % prognostiziert. Dieses Protokoll für die Maus einrichten konnten jetzt auf Eizellen anderer Arten, einschließlich des Menschen getestet werden.
Introduction
Weiblicher Unfruchtbarkeit ist eine Pathologie, die sich eine steigende Zahl von Frauen auswirkt. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind rund 20 % aller Paare unfruchtbar, mit einer 40 % aufgrund von Unfruchtbarkeit bei Frauen. Darüber hinaus ist ein Drittel der Frauen in der Krebs-Behandlungen (300.000/Jahr und 30.000/Jahr in den USA oder Italien, beziehungsweise) vorzeitige Ovarialinsuffizienz zu entwickeln.
Eine Strategie zur Unfruchtbarkeit bei Krebspatienten zu verhindern ist die Isolation und Kryokonservierung von Eibläschen vor der onkologischen Behandlung, gefolgt von in-vitro- Reifung (IVM) der GV Eizellen auf die MII-Bühne (GV-MII-Übergang). Die Verbesserung der Verfügbarkeit von nicht-invasive Marker der Eizelle Entwicklungskompetenz würde die Befruchtung und Entwicklungsprozesse und die gesamte Schwangerschaft Erfolg1,2.
Anhand ihrer Chromatin-Konfiguration nach der Färbung mit der supravital Fluorochrom Hoechst 33342, beobachtet Säugetier-ausgewachsene Eizellen werden entweder als umgeben Nukleolus (SN) oder eine nicht umgeben Nukleolus (NSN)3eingestuft. Neben ihrer unterschiedlichen Chromatin Organisation zeigen diese beiden Arten von Eizellen viele morphologische und funktionelle Unterschiede3,4,5,6,7,8 ,9, einschließlich ihrer meiotische und entwicklungspolitische Kompetenz. Wenn aus dem Eierstock isoliert und in Vitro gereift, Art von Eizellen Reichweite die MII-Bühne, sowohl nach Sperma Besamung, zu entwickeln, um das 2-Zell-Stadium, aber nur diejenigen mit einer SN Chromatin Organisation können zum Begriff9entwickeln. Obwohl gut wie eine Klassifizierungsmethode für die Auswahl der zuständigen vs. inkompetent Eizellen, ist der Hauptnachteil die mutagene Wirkung, die das Fluorochrom selbst und vor allem das UV-Licht verwendet für seine Entdeckung auf die Zellen haben könnte.
Aus all diesen Gründen suchten wir für andere nicht-invasive Marker, die mit der SN oder NSN Chromatin-Konformation, die die Verwendung von Hoechst unter Beibehaltung der gleichen hohen Klassifizierung Genauigkeit ersetzen könnte. Die Time-Lapse Beobachtung der zytoplasmatischen Bewegung Geschwindigkeiten (CMVs) taucht als ein Merkmal Kennzeichen der Status der Zelle. Zum Beispiel demonstriert neuere Studien, dass die Zuordnung zwischen CMVs zum Zeitpunkt der Befruchtung und die Fähigkeit der Maus und menschlichen Zygoten, komplette Präimplantationsdiagnostik und voll ausgetragenen Entwicklung10,11aufgenommen.
Basierend auf diesen früheren Studien, beschreiben wir hier eine Plattform für die Anerkennung von entwicklungspolitisch zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen5,6,7,8. Die Plattform basiert auf drei wesentlichen Schritten: 1) Oozyten isoliert von antrale Follikel werden zuerst eingestuft anhand ihrer Chromatin-Konfiguration entweder als ein umgeben Nukleolus (SN) oder ein nicht-umgeben Nukleolus (NSN); (2) Zeitraffer Bilder von CMVs, die während des GV-MII Übergangs jede einzelne Eizelle entnommen und analysiert mit Particle Image Velocimetry (PIV); und 3) mit PIV gewonnenen Daten werden mit einem Feed-Forward künstliche neuronale Netzwerk (FANN) für blinde Klassifizierung12,13analysiert. Wir geben die wichtigsten Schritte des Verfahrens für die Maus, um es bereit getestet und verwendet werden für andere Säugetierarten (z. B. Rinder, Affen und Menschen) entwickelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte, die eine kümmern sollte während der Durchführung dieses Protokolls Maus Eizellen sowie mit anderen Arten. Einmal aus den Follikeln isoliert, Eizellen übertragen werden sollte sofort in die Aufnahme sinkt, wie die Trennung von der Begleiter Cumulus löst Zellen Anfang des GV-MII Übergangs. Eine mögliche Änderung dieses Protokolls konnte die Zugabe von 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) M2 Medium für COCs Isolierung verwendet werden. IBMX verhindert die sofortige Auslösung des GV-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde möglich dank der Unterstützung von: Universität von Pavia BRD 2016; Universität Parma FIL 2014, 2016; und Kinesis für die Versorgung der Kunststoffprodukte notwendig, diese Studie durchzuführen. Wir danken Dr. Shane Windsor (Faculty of Engineering, University of Bristol, UK) für die Bereitstellung der Cell_PIV-Software.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
